Untersuchungen zu neuen, am vaskulären Umbau von idiopathischer und sekundärer pulmonal-arterieller Hypertonie beteiligten Genen

Abstract

Die pulmonale Hypertonie (PH) tritt idiopathisch (IPAH/FPAH) oder sekundär alsFolge anderer Erkrankungen auf. Bei der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung(COPD) und nach chronischer Hypoxie kann sich eine PH über eine hypoxischeVasokonstriktion entwickeln. Allen Formen gemeinsam ist ein pulmonalerWiderstandshochdruck und ein Gefäßumbau der Pulmonalarterien (vascularremodelling). Die zugrunde liegenden Signalwege sind nur lückenhaft bekannt.In dieser Arbeit sollten 6 Kandidatengene und -proteine (FHL-1, S100 A4, BDNF,TrkB, TSP-1 und CD36), die zuvor im Mausmodell der Hypoxie-bedingten PH alsreguliert identifiziert wurden, bei idiopathischer und sekundärer PH charakterisiertwerden. In einem ersten Schritt wurden Proben von Lungenhomogenat aus IPAH undCOPD-Patienten mit denen von Spendern verglichen. Dazu wurden quantitativePCR und Western Blot eingesetzt. FHL-1, S100 A4, BDNF und TrkB zeigten in IPAH undCOPD-Patienten eine veränderte mRNA-Expression im Vergleich zu denSpendern. Zudem zeigten sich Regulationen in IPAH- und COPD-Patienten aufProteinebene (IPAH: FHL-1 und CD36; COPD: TSP-1). Um möglicheExpressionsveränderungen im vaskulären Kompartiment zu beurteilen, wurdenprimäre pulmonal-arterielle Gefäßmuskelzellen (PASMC) und Fibroblasten derAdventitia isoliert und unter normoxischen Bedingungen kultiviert (FiO2=0,21).Expressionsveränderungen der Kandidatengene und -proteine (FHL-1, S100 A4,BDNF, TrkB, TSP-1 und CD36) in IPAH- und COPD-Patienten wurden mit denen vonSpendern verglichen. Hierzu wurden die quantitative PCR, Western Blot und dieindirekte Immunfluoreszenz eingesetzt. Es bestätigte sich eine differentielle mRNA-Expression in isolierten Primärzellen aus IPAH- (PASMC: FHL-1, TrkB und CD36)und COPD-Lungen (PASMC: FHL-1; adventitielle Fibroblasten: BDNF und TSP-1).Zudem wurde FHL-1 in isolierten primären PASMC und adventitiellen Fibroblastenaus IPAH-Lungen auf Proteinebene als reguliert gefunden. In einem nächsten Schrittwurde die basale Expression der Kandidatengene und -proteine mit der Expressionnach Hypoxiestimulation verglichen (24h; FiO2=0,01). Auf mRNA-Ebene führte dieHypoxiestimulation zu einer differentiellen Expression in Zellen aus IPAH-(adventitielle Fibroblasten: FHL-1 und TSP-1) und COPD-Lungen (PASMC: S100 A4und TrkB; adventitielle Fibroblasten: FHL-1, TSP-1 und CD36).Weiterhin wurde die zelluläre Lokalisation der Kandidatenproteine in PASMCund adventitiellen Fibroblasten mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Es zeigte sich in erster Linie eine Lokalisation im Zytoplasma.Die Ergebnisse belegen, dass die untersuchten Gene und Proteine im Gefäßumbauim Rahmen der IPAH und COPD-assoziierten PH reguliert sind. Die gewonnenenErgebnisse weisen auf eine Beteiligung zugrundeliegender Signalkaskaden in IPAHund COPD-assoziierter PH hin. Zudem könnten sie Ansatzpunkte für neuediagnostische und therapeutische Verfahren werden. Pulmonary hypertension exists in an idiopathic form (IPAH/FPAH) as well assecondary to different diseases. In chronic obstructive lung disease (COPD) andchronic hypoxia, pulmonary hypertension may develop via hypoxic vasoconstriction.All forms of pulmonary hypertension are characterised by an increase of pulmonaryresistance followed by vascular remodelling. The underlying signalling pathways arepoorly understood.In previous studies, using the mouse model of hypoxia-induced pulmonaryhypertension, six candidate genes and proteins (FHL-1, S100 A4, BDNF, TrKB, TSP-1 and CD36) were identified to be regulated in vascular remodelling. The aim of thisstudy was to characterise their role in vascular remodelling of idiopathic andsecondary pulmonary hypertension in humans. At first, samples from lunghomogenate of IPAH and COPD patients were compared to donors usingquantitative PCR and Western Blot. The mRNA expression levels for FHL-1, S100A4, BDNF and TrkB revealed higher regulation in IPAH and COPD patients ascompared to donor lungs. In addition, protein levels were regulated in IPAH andCOPD patients (IPAH: FHL-1 and CD36; COPD: TSP-1). Focussing on the vascularcompartment of IPAH and COPD lungs, primary pulmonary arterial smooth musclecells (PASMC) and adventitial fibroblasts were isolated and cultivated undernormoxic conditions (FiO2=0.21). Expression levels of FHL-1, S100 A4, BDNF, TrkB,TSP-1 and CD36 in cells from IPAH and COPD patients were compared to donorsusing quantitative PCR, Western Blot and indirect immunofluorescence. DifferentialmRNA expression levels were confirmed to be regulated in isolated primary cells ofIPAH (PASMC: FHL-1, TrkB and CD36) and COPD lungs (PASMC: FHL-1;adventitial fibroblasts: BDNF and TSP-1). In addition, FHL-1 showed pronouncedprotein levels in isolated primary PASMC and adventitial fibroblasts of IPAH lungs.Furthermore, basal expression levels were compared to those under hypoxicstimulation (24h; FiO2=0.01). On mRNA level, hypoxic stimulation were leading to adifferential expression in cells of IPAH (adventitial fibroblasts: FHL-1 and TSP-1) and COPD lungs (PASMC: S100 A4 and TrkB; adventitial fibroblasts: FHL-1, TSP-1 andCD36).Using indirect immunofluorescence we checked for cellular localisation of thecandidate proteins in PASMC and adventitial fibroblasts. Predominantly, most of theproteins were localising to the cytoplasm.This report shows differential expression levels of the examined genes and proteinsin vascular remodelling of IPAH and COPD-associated pulmonary hypertension. Theresults point to an involvement of the underlying signalling cascades in IPAH andCOPD-associated pulmonary hypertension and could be of interest for new diagnostic and therapeutic strategies.