Persistence of H4N6, H5N1, and H6N8 avian influenza viruses, H1N1 human influenza virus, and two model viruses (NDV and ECBO) in various types of water, lake sediment, duck feces, and meat

Abstract

Die vorliegende Untersuchung wurde durchgeführt, um die Persistenz von AIV in einer Vielfalt von kontaminierten Medien und Substraten unter unterschiedlichen Umweltbedingungen zu untersuchen. Wildwasservögel dienen als Reservoir für Influenza-A-Viren. Infizierte Vögel scheiden eine hohe Anzahl an Viren über die nasale Sekretion und den Kot aus. Dies führt zu einer erheblichen Kontamination der Umwelt. Um die Tenazität dieser Viren unter natürlichen Bedingungen zu bestimmen, wurde die Persistenz von drei LPAI-Viren (H4N6, H5N1, H6N8), eines humanen Influenza-Viruses (H1N1) und von zwei Modellviren (NDV und ECBO) in unterschiedlichen Wasserarten (destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung und Oberflächenwasser), in Seesediment, Entenkot und Entenfleisch bei 10 °C, 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C über eine lange Zeitdauer bestimmt.Das NDV und die Influenzaviren wurden im Allantoissack von 9-11 Tage alten SPF-Hühnerembryonen vermehrt, während das ECBO-Virus in MDBK-Zellkulturen vermehrt wurde. Für die Tenazitätsuntersuchungen in Wasser wurden das destillierte Wasser und die physiologische Kochsalzlösung autoklaviert, während das Oberflächenwasser, das aus dem Bodensee entnommen wurde, ohne Behandlung verwendet wurde. Die Virusquantifizierung wurde zu Beginn der Versuche und dann anschließend in regelmäßigen Zeitabständen mit der Endpunktverdünnungsmethode auf MDCK-Zellen für Influenzaviren, auf Vero-Zellen für NDV und auf MDBK-Zellen für ECBO-Virus durchgeführt. Die Virustiter wurden als TCID50/ml mit der Spearman-Kärber-Formel errechnet. Aus allen Behandlungsgruppen wurden jedes Mal Doppelproben über die Dauer von maximal 36 Wochen untersucht. Die Daten, die der Reihe nach erhalten wurden, wurden mit einem linearen Regressionsmodell analysiert, um die D-90-Werte (benötigte Zeit für die Reduktion der Viruskonzentration um eine Log10-Stufe) zu berechnen und damit die geschätzte Persistenz der Virusinfektiosität bei einer Virusstartkonzentration von 106,00 TCID50/ml.Die Infektiosität der Influenzaviren blieb am längsten in destilliertem Wasser erhalten, gefolgt von physiologischer Kochsalzlösung und Oberflächenwasser. Die einzelnen Influenzaviren waren bei allen Versuchsbedingungen in ihrer Sensitivität gegenüber der Inaktivierung nicht einheitlich. Die D-90-Werte der Influenzaviren in beimpftem destilliertem Wasser bewegten sich zwischen 5-13 Tagen bei 30 °C, 14-37 Tagen bei 20 °C, 62-197 Tagen bei 10 °C und 205-558 Tagen bei 0 °C und 202-642 Tagen bei 10 °C. Die virale Persistenz war kürzer in Oberflächenwasser im Vergleich zu destilliertem Wasser und dieser Trend war bei unterschiedlichen Temperaturen variabel: bei 30 °C und 20 °C war die Persistenz 3-5 mal kürzer, während sie bei niedrigeren Temperaturen in Oberflächenwasser 8-12 mal kürzer war als in destilliertem Wasser. Die mikrobiologischen Analysen zeigten eine Zunahme im Bakteriengehalt bei den mit Virus beimpften Oberflächenwasserproben bei der Lagerung bei 30 °C, 20 °C und 10 °C. Um die Stabilität von viraler RNA in Oberflächenwasserproben zu untersuchen, wurden mit H4N6-Virus, H5N1-Virus und H6N8-Virus beimpfte Oberflächenwasserproben mit der qRRT-PCR zu Beginn der Versuche und nach der Lagerung bei den verschiedenen Temperaturen untersucht. Eine signifikante Menge an viraler RNA war in den kontaminierten Wasserproben bei allen Temperaturen noch feststellbar, nachdem das Virus bei der Titration in Zellkultur nicht mehr nachweisbar war. Die Rate des viralen RNA-Abbaus war größer bei hohen als bei niedrigeren Temperaturen.Eine Keimträgertechnik wurde angepasst, um die Persistenz von Influenzaviren in verschiedenen Substraten zu untersuchen. Elektropositiv geladene Zeta Plus Virosorb-Filterscheiben, die in einer Polycarbonat-Membran mit einer Porengröße von 10 nm eingepackt waren, wurden als Sandwich-Keimträger verwendet. Um die Adsorption von Influenzaviren an die Filterscheiben zu ermöglichen, wurde Phosphatbeladungspuffer mit 3 unterschiedlichen pH-Werten (6,00; 6,50 und 7,40) getestet. Keimträger mit hohen Virustitern wurden mit Phosphatbeladungspuffer bei einem pH-Wert von 7,40 erzeugt. Außerdem wurde ein enormer Verlust bei der Viruskonzentration beobachtet, wenn Filterscheiben, die mit H5N1 beimpft waren, über 6 h trocken aufbewahrt wurden, während der Verlust der Viruskonzentration nur geringfügig war, wenn die beladenen Filterscheiben unter feuchten Bedingungen gelagert wurden. Sandwich-Keimträger wurden zuerst verwendet, um die Persistenz der Influenzaviren und der Modellviren in Oberflächenwasser abzuschätzen. Die Persistenz von allen Viren war bei 10 °C am höchsten, gefolgt von 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C. Bei 10 °C resultierte ein einziger Gefrier-Auftau-Zyklus unabhängig von der Lagerdauer in einer abrupten Abnahme im Virustiter, gefolgt von einer Langzeitpersistenz. Interessanterweise persistierten AIV länger in Oberflächenwasser, wenn sie an Keimträgern absorbiert waren, als wenn sie frei in Wasser suspendiert waren. Die D-90-Werte der an Filter adsorbierten AIV nahmen um das drei- bis vierfache bei 10 °C, um das zweifache bei 0 °C, 20 °C und 30 °C und nur geringfügig bei 10 °C im Vergleich zu frei suspendierten Viren zu. In Wasserproben, in denen die Keimträger gelagert wurden, wurde kein Virus nachgewiesen, während die Influenzaviren und Modellviren von den Filterscheiben, die bei niedrigen Temperaturen gelagert wurden, während des ganzen Untersuchungszeitraums erfolgreich eluiert und quantifiziert werden konnten. Dies erlaubt den Einsatz der Technik bei Tenazitätsuntersuchungen in großtechnischem Maßstab.Das Überleben der Influenzaviren und der Modellviren wurde ebenso in Seesediment, Entenkot und Fleisch unter der Verwendung der Sandwich-Keimträgertechnik zahlenmäßig bestimmt. Unter all diesen Substraten war die virale Persistenz in Seesediment am höchsten, verglichen mit Entenkot und Fleisch, in denen die Viruspersistenz ähnlich war. In Seesediment war die Persistenz von AIV sogar höher als in Oberflächenwasser, was anzeigt, dass Sediment die Viren vor den Inaktivierungsfaktoren, die in der Umwelt vorhanden sind, schützen und somit das Überleben der Viren verlängern kann. In Entenkot schwankten die D-90-Werte der Influenzaviren von 1-2 Tage bei 30 °C, 4-7 Tage bei 20 °C, 14-21 Tage bei 10 °C, 47-75 Tage bei 0 °C und 53-71 Tage bei 10 °C. In Entenfleisch wurden sehr ähnliche D-90-Werte ermittelt. Zwei Modellviren (NDV und ECBO-Virus) wurden in die Studie aufgenommen, stellvertretend für behüllte und unbehüllte Modellviren und für den direkten Vergleich mit Influenzaviren, da sie als Testorganismen für virale Tenazitätsuntersuchungen dienen. Im Allgemeinen war die Persistenz von NDV und ECBO-Viren in allen Wasserarten und in all den Substraten durchweg höher als die der Influenzaviren. Von den Modellviren hatte jedoch ECBO-Virus als ein unbehülltes Virus die höheren D-90-Werte, während das behüllte NDV die niedrigeren D-90-Werte hatte, die bei allen Temperaturen denen der Influenzaviren ähnlich waren. Dies zeigt, dass NDV ein Surrogat-Virus für Persistenz- und Inaktivierungsuntersuchungen an AIV sein kann, indem es eine leicht höhere Tenazität als diese Viren hat, was einen ausreichenden Sicherheitsspielraum bei der Interpretation von Ergebnissen gewährleistet.Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstreichen die Wichtigkeit der Wasserbiotope beim Fortbestand und bei der Verbreitung von AIV in der Umwelt. Bei niedrigen Temperaturen können AIV in Oberflächenwasser, Seesediment, Entenkot und Fleisch über einen längeren Zeitraum infektiös bleiben, was die Persistenz der Viren in der Umwelt über den Winter ermöglicht. The present study was designed to investigate the persistence of AIV in a variety of contaminated media and substrates under diverse environmental conditions. Wild aquatic birds serve as a reservoir of influenza A viruses. The infected birds excrete a large number of viruses through their nasal secretion and feces that leads to heavy contamination of the environment. In order to determine the tenacity of these viruses under natural environmental conditions, the persistence of three LPAI viruses (H4N6, H5N1, H6N8), one human influenza virus (H1N1), and two model viruses (NDV and ECBO) was calculated in various types of waters (DW, NS, and SW), lake sediment, duck feces, and duck meat at -10, 0, 10, 20, and 30 °C for extended periods of time. The NDV and influenza viruses were propagated in the allantoic sac of 9-11 day old SPF chicken embryos while ECBO was propagated in MDBK. For the tenacity studies in water, DW and NS were autoclaved while SW collected from Lake Constance was used without any treatment. Viral quantitation was performed in the beginning of trials and then afterwards at regular intervals by the end point serial dilution method on MDCK for influenza viruses, Vero cells for NDV, and MDBK for ECBO. The virus titers were calculated as TCID50/ml by the Spearman-Kärber method. Duplicate samples were tested each time for all of the treatment groups for a maximum of 36 weeks. The sequential data thus obtained was analyzed by a linear regression model to calculate T-90 values (time required for one log reduction in the virus titer) and the estimated persistence of viral infectivity with a starting viral concentration of 106.00 TCID50/ml. The infectivity of the influenza viruses was preserved for a maximum period of time in DW followed by in NS and SW and the individual influenza viruses were also inconsistent in their sensitivity to inactivation under all experimental conditions. T-90 values of the influenza viruses in the inoculated DW ranged between 5-13 days at 30 °C, 14-37 days at 20 °C, 62-197 days at 10 °C, 205-558 days at 0 °C, and 202-642 days at -10 °C. The viral persistence was shorter in SW than DW and this trend was variable at different temperatures: at 30 and 20 °C the persistence was 3-5 times shorter while at lower temperatures it was 8-12 times shorter in SW than in DW. The microbiological analysis showed an increase in the bacterial counts of the virus inoculated SW samples after storage at 30, 20, and 10 °C. To check the stability of viral RNA in the SW samples, H4N6, H5N1, and H6N8 inoculated SW samples were processed for quantitation of viral RNA by qRRT-PCR reaction at the start of the experiments and after storage at various temperatures. A significant amount of viral RNA was still detectable in the contaminated water samples at all temperatures after the virus was no longer detectable by cell culture titration. The rate of viral RNA degradation was faster at high temperatures than at lower ones.A germ carrier technique was adapted to study the persistence of influenza viruses in various substrates. Electro positively charged Zeta Plus Virosorb filters discs wrapped in a polycarbonate membrane of 10 nm pore size were used as sandwich germ carriers. To facilitate the adsorption of influenza viruses to the filter discs, PLB adjusted to three pH values (6.00, 6.50, and 7.40) was checked and the one with a pH 7.40 produced germ carriers with high virus titer. Furthermore, an enormous loss of virus titer was recorded when the filter discs inoculated with H5N1 virus were kept dry for 6 hours while a negligible loss of the virus titer was observed when loaded filter discs were kept under moist conditions. Sandwich germ carriers were first used to estimate the persistence of influenza and model viruses in SW. Persistence of all of the viruses was highest at -10 °C followed by 0, 10, 20, and 30 °C. At -10 °C, the single freeze-thaw cycle resulted in an abrupt decline in the virus titer, followed by long term persistence. Interestingly, the AIV persisted longer in SW using the germ carrier technique as compared to suspending the viruses in the water. The T-90 values of the filter bound AIV increased three to four folds at -10 °C, two-fold at 0, 20, and 30 °C, and slightly at 10 °C compared to the suspended viruses in the SW. No virus was detected in water samples in which germ carriers were incubated while successful recovery of eluable virus from filter discs stored at low temperatures was possible for influenza and model viruses during whole study period, making the technique suitable for use in large-scale tenacity studies. The survival of influenza and model viruses was also evaluated in lake sediment, duck feces, and meat using the sandwich germ carrier technique. Among all of these substrates, viral persistence was highest in the lake sediments as compared to duck feces and meat, in which the virus persistence was quite similar. In lake sediment, the persistence of the AIV was even higher than in the SW which indicates that sediment can protect the viruses from the inactivating factors present in the surrounding environment and prolong viral survival. In duck feces, the T-90 values of influenza viruses ranged from 1-2 days at 30 °C, 4-7 days at 20 °C, 14-21 days at 10 °C, 47-75 days at 0 °C, and 53-71 days at -10 °C and equivalent T-90 values were also recorded in the duck meat. Two model viruses were incorporated into this study to serve as representative enveloped and non-enveloped model viruses and for direct comparison with influenza viruses as these viruses serve as test organisms in viral tenacity studies. Generally, in all of the water types and within all of the substrates, the persistence of NDV and ECBO viruses was consistently higher than that of influenza viruses. However, of the model viruses, ECBO as a non-enveloped virus had higher T-90 values while NDV, as an enveloped virus, had lower T-90 values which are much closer to those of the influenza viruses at all temperatures. This indicates that NDV may be a good surrogate virus for studying the persistence and inactivation of AIV, as it has a slightly higher tenacity than those viruses, allowing for a sufficient margin of safety in interpretation of results. The findings of the present study underline the importance of the aquatic habitat in the maintenance and spread of AIV in the environment. At lower temperatures, AIV can remain infectious in SW, lake sediments, duck feces, and meat for extended periods of time, allowing persistence of the viruses in the environment over winter.