Untersuchungen zur zellulären Immunantwort sowie zu wirtszellgebundenen Reaktionen gegen Eimeria bovis-Infektionen

Abstract

Die individuell variierende Empfänglichkeit von Kälbern für eine E. bovis-Erstinfektion könnte mit unterschiedlich stark ausgeprägten, nicht-adaptativen Immunreaktionen zusammen-hängen. Um deren Natur zu überprüfen, wurden Analysen zu Interaktionen von Monozyten, Makrophagen, NK-Zellen und PMN mit E. bovis-Sporozoiten durchgeführt. Während Monozyten nur eine geringe Reaktivität nach Konfrontation mit E. bovis-Sporozoiten in vitro zeigten, waren alle anderen Zelltypen hochreaktiv, führten zur m. o. w. stark ausgeprägten Elimination der Parasiten und produzierten (mit Ausnahme der NK-Zellen) immun-modulatorisch wirkende Mediatoren. Immunhistologische Untersuchungen zeigten, dass der Makrophagenbesatz der infizierten Darmschleimhaut nach Primär- und Reinfektion zunehmend gesteigert ist. Sowohl PMN als auch Monozyten reagierten ex vivo im Infektionsverlauf mit gesteigerten Phagozytose- und Oxidative Burst-Aktivitäten. PMN-vermittelte Reaktionen führten zudem zu der hier erstmalig für die Abwehr von Eimeria-Stadien beschriebenen Bildung sog. Neutrophil extracellular traps , mit der Sporozoiten zwar nicht abgetötet wurden, jedoch über Vernetzung immobilisiert und an der Invasion von Wirtszellen gehindert wurden. Insgesamt ließen die Ergebnisse auf eine wichtige Beteiligung der oben genannten Zellen an der initialen Abwehr der E. bovis-Infektion schließen.Adaptative Immunreaktionen spielen generell eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Eimeria-Infektionen, sowohl bezüglich der Kontrolle von Erstinfektionen als auch der Entwicklung der Immunität gegen Reinfektionen. Die Überprüfung solcher Reaktionen bei PBMC E. bovis experimentell primär- und reinfizierter Kälber verdeutlichte eine anhand antigenspezifischer T-Zellproliferation und zeitgleicher Synthese von IFN-γ und IL-2 als Th1-dominiert einzustufende Immunreaktion in der Präpatenz der Erstinfektion. Anschließend waren mit beginnender Patenz die Immunreaktionen über IL-4 eher Th2-orientiert und die PBMC proliferierten nicht mehr. Sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen wurden als Quelle der IFN-γ-Synthese in der Primärinfektion identifiziert, während IL-2 und IL-4 in erster Linie von CD4+ T-Zellen gebildet wurden. Lymphknotenlymphozyten reagierten insgesamt ähnlich wie PBMC, wobei es unerheblich war, aus welchem Lymphknoten sie stammten. PBMC primär-infizierter Tiere reagierten zusätzlich im Verlauf der Infektion in Antigen-unabhängiger Weise mit einer vermehrten Produktion von IFN-γ und IL-4, was einen bisher nicht beschriebenen Mechanismus bei Eimeria-Infektionen darstellt. Anhand von FACS-Analysen ließ sich nach Erstinfektion im peripheren Blut eine Expansion der CD4+-T-Zellen beobachten. Auf den Anteil der CD8+- und γδ-TCR+-positiven Zellen hatten die Infektionen kaum Einfluss. Nach Reinfektion blieben sowohl antigenspezifische proliferative Aktivitäten und Expansion der T-Zellsubpopulationen als auch Zytokinsynthese mit Ausnahme von IL-4 völlig aus, was einen frühen Abbruch der Reinfektion noch vor Entwicklung derjenigen Stadien, die während der Primärinfektion Reaktionen hervorgerufen hatten, vermuten lässt. Die Infiltration der infizierten Darmschleimhaut sowohl während der Primär- als auch der Reinfektion mit CD4+- und CD8+-T-Zellen lässt insgesamt auf protektive Funktionen beider Zelltypen schließen.E. bovis-Sporozoiten infizieren mit Endothelzellen hochreaktive Zellen, die ein breites Spektrum an pro-inflammatorischen und immunmodulatorischen Molekülen produzieren können und zudem sehr empfindlich auf widrige Bedingungen reagieren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass Infektionen mit E. bovis-Sporozoiten im Gegensatz zu solchen mit Tachyzoiten der nahe verwandten Arten T. gondii und N. caninum innerhalb von 3 Tagen p. i. zur vergleichsweisen schwachen Induktion immunmodulatorischer Mediatoren führt. Analysen zur Modulation des Wirtszelltranskriptoms 4 Stunden und 4 Tage nach der Infektion bestätigen dies. Dagegen erfolgte am Tag 8 der Merogonie I eine pro-inflammatorisch ausgerichtete Immunreaktion der Wirtszellen. Das transkriptionelle Profil von mit E. bovis-Sporozoiten infizierten bovinen Endothelzellen ließ insgesamt auf eine Zweiteilung der parasiten-induzierten Modulation der Wirtszelle schließen. Während in der Frühphase mit 4 Stunden und 4 Tage p. i. der Einfluss des Parasitens auf das Wirtszelltranskriptom gemessen an der Zahl regulierter Gene schwach war und eher eine hemmende Wirkung auf die Aktivierung der Endothelzellen vermuten ließ, kam es ab beginnender Proliferation des Parasitens 8 und 14 Tage p. i. zum massiven Eingriff in die wirtszelleigene Transkriptionsmaschinerie. Dabei waren diverse funktionelle Bereiche der Wirtszelle betroffen. Mit zunehmender Infektionsdauer nahm E. bovis vermehrt Einfluss auf Zellwachstum und -Proliferation, den Zell-Zyklus, den Zell-Tod sowie den wirtszelleigenen Metabolismus. Die Qualität der Regulation lassen auf eine parasiten-induzierte Hemmung der Apoptose und auf eine Arretierung des Zellzyklus als auch auf eine zunehmende Ausbeutung der wirtszelleigenen Nährstoffe zur Erleichterung der Parasitenproliferation schließen. Während die Nährstoffbedürfnisse von E. bovis bisher völlig unbekannt waren, weist die Induktion charakteristischer metabolischer Moleküle erstmalig auf eine Abhängigkeit des Parasitens von der zellulären Cholesterolsynthese während der proliferativen Phase hin.Gegen Ende der Merogonie I durchgeführte Proteomanalysen verdeutlichten dagegen, dass der Parasit zum Zeitpunkt der Merozoiten I-Freisetzung in erster Linie den Status quo der Wirtszelle erhält indem er z. B: weiterhin ihre Apoptose verhindert. Ansonsten wurde das Gros der nachgewiesenen Moleküle in seiner Abundanz vermindert, was mit auch mit einem Erschöpfungszustand der Wirszelle zusammenhängen könnte. Primary-infected calves show individually varying susceptibilities for E. bovis which may be based on differentially displayed innate immune reactions. To characterize such reactions we analysed interactions of PMN, monocytes, macrophages and NK-cells with E. bovis sporozoites. Besides monocytes, all other cell types showed high reactivity in vitro leading to sporozoite elimination and to the production of various immunomodulatory molecules (except for NK cells). Immunohistology revealed enhanced infiltration of macrophages in gut mucosa of primary and challenge infected animals. Both PMN and monocytes displayed increased phagocytic and oxidative burst activities ex vivo during E. bovis infection. Moreover, upon exposure to sporozoites, PMN reacted by the formation of neutrophil extracellular traps (NETs) which is a newly described effector mechanism against Eimeria stages. NET formation did not directly promote parasite death but led to sporozoite immobilisation and subsequent inhibition of host cell infection. Overall, the data indicate an important role of innate immune reactions in E. bovis defense.Adaptive immune reactions against Eimeria species generally lead to control of primary infection and promote immunity against reinfections. We here analyse adaptive immune reactions of E. bovis primary and challenge infected calves. Primary infection was characterised by Th1-dominated immune responses in prepatency as measured by enhanced antigen-specific cell proliferation and IFN-γ/IL-2 gene transcription in PBMC. Thereafter, the augmented production of IL-4 in PBMC with beginning patency indicated a switch to Th2-associated immune reactions. Overall, lymphocytes isolated from lymph nodes reacted equally as PBMC. Besides antigen-specific reactions we also found an infection-triggered induction of the non-specific activation state of PBMC in the course of primary infection as detected by enhanced intracellular IFN-γ and IL-4 content of phorbol-12-myristate-13-acetate/ionomycin-stimulated PBMC. This may represent a new mechanism of immune cells of E. bovis-infected calves contributing to ongoing immune reactions. FACS analyses revealed an expansion of CD4+ T cells during primary infection, whilst CD8+ and γδ-TCR+ T cell were hardly affected. After homologous reinfection PBMC neither proliferated nor produced cytokines, except for IL-4, suggesting an early abrogation of parasite development. Both E. bovis primary and challenge infections had an impact on local tissue T cell distribution. Primary infection was characterised by a CD4+ T cell infiltration early in prepatency in ileum and later in colon mucosa, whereas CD8+ T cells were only found accumulating in the latter gut segment. Challenge infection led to infiltration of both CD4+ and CD8+ T cells in small intestine and large intestine segments indicating protective functions of both cell types. In vivo E. bovis sporozoites must invade endothelial cells, which are highly immuno-reactive cells being able to produce a broad range of pro-inflammatory and immunomodulatory molecules. However, infections of BUVEC with E. bovis sporozoites led to a much weaker induction of host cell-derived immunomodulatory molecules within 3 days after infection than infections with tachyzoites of the closely related T. gondii and N. caninum. Analyses on the E. bovis-mediated modulation of the host cell transcriptome 4 hours and 4 days p. i. confirmed these results. In contrast, 8 days p. i. host cell response was characterised by a strong pro-inflammatory reaction indicating host cell activation.Considering the numbers of E. bovis-regulated genes, the results of microarray-based transcriptional profiling suggested that merogony I was dissected in an early low-responsive phase and a late, highly reactive one beginning with the onset of parasite proliferation. Thus, 4 hours and 4 days p. i. host cells hardly reacted on the transcriptional level and E. bovis infection rather led to inhibition of host cell activation. Beginning with parasite proliferation at day 8 p. i. E. bovis increasingly regulated the transcriptional machinery influencing various functional categories of host cell transcriptome. With increasing merogony I duration E. bovis escalated its influence on molecules involved in cell growth/proliferation, cell cycle, cell death and host cell metabolism. The nature of regulation suggested parasite-induced inhibition of apoptosis and an arrest of cell cycle both allowing for parasite proliferation. Moreover, E. bovis increasingly exploited host cell nutritients during merogony I. So far, nothing was known on the precise nutritional needs of E. bovis. The induction of characteristic metabolic molecules measured in this work indicates the dependency of this parasite on host cell cholesterol synthesis during its proliferative phase.Analyses of host cell proteome modulation at the very end of E. bovis merogony I suggest that the parasite sustains the status quo of the host cell to support its merozoite I formation and release. Parasite-induced differences in protein abundance concerned distinct functional categories, with most proteins being involved in host cell metabolism, cell structure, protein fate and gene transcription. The majority of modulated molecules were down-regulated and some regulated molecules indicated inhibition of host cell apoptosis allowing the parasite to complete its development.