Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Glutamat-Dehydrogenasen aus Plasmodium falciparum

Abstract

Die Resistenzentwicklung des bedeutendsten humanpathogenen Malariaerregers, Plasmodium falciparum, gegen vorhandene Wirkstoffe, nimmt seit den 60er Jahren stetig zu und bedingt seit den 90er Jahren nahezu 50 % der Gesamtsterblichkeitsrate innerhalb der afrikanischen Bevölkerung. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung, neue Zielmoleküle zu identifizieren und darauf basierend effizienter wirkende Antimalariamedikamente zu entwickeln. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Glutamat-Dehydrogenasen 2 und 3 aus Plasmodium falciparum detailliert auf molekularer Ebene zu charakterisieren, um letztlich ihre Eignung als sogenannte drug targets zu validieren. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der biochemischen und strukturellen Charakterisierung des zweiten Glutamat-Dehydrogenase Isoenzyms aus Plasmodium falciparum. Die Klonierung unterschiedlich langer PfGDH2 Konstrukte, die heterologe Überexpression dieser in E. coli Zellen und eine anschließende Separation der Proteine aus dem Bakterienlysat erbrachte letztlich ein um 49 Aminosäuren verkürztes, katalytisch aktives Enzym. Anschließend wurde die PfGDH2 (hemm-)kinetisch charakterisiert. Weiterhin wurde über proteinkristallographische Methoden die dreidimensionale Kristallstruktur des rekombinanten PfGDH2 Proteins bestimmt. Eine Überlagerung dieser Struktur mit denen bereits charakterisierter GDHs, zeigte eine große Übereinstimmung der Sekundärstrukturmerkmale mit Glutamat-Dehydrogenasen der S_50I Familie unterschiedlicher Organismen. Die an der Koordination der Substrate beteiligten Aminosäurereste sind auch in diesem Protein stark konserviert. Eine Analyse der Monomer-Monomer-Interaktionen ergab jedoch deutliche Unterschiede im Vergleich zum bereits charakterisierten ersten GDH-Isoenzym aus Plasmodium falciparum.Untersuchungen zur Lokalisation aller drei GDH-Proteine des Parasiten über Fusionsproteine mit dem green fluorescent protein (GFP) wurden durchgeführt, wodurch Hinweise darauf, in welcher Art und Weise alle bekannten Glutamat-Dehydrogenasen des Parasiten miteinander in Verbindung stehen, erhalten wurden. In silico Untersuchungen, wie das virtuelle Docking zur strukturbasierten Wirkstoffsuche, an den zwei charakterisierten plasmodialen Enzymen sowie dem humanen Vergleichsenzym, validierten die experimentell bestimmten Ergebnisse. Auf Grund der enormen Größe des dritten PfGDH Isoenzyms waren keine experimentellen Untersuchungen, sondern lediglich prädiktive Analysen zur Funktion dieses Proteins möglich. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um eine NAD+-abhängige Glutamat-Dehydrogenase der L_180 Familie, die Hexamere ausbildet, um katalytisch aktiv zu sein. Durch die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse konnten neue Einblicke in Struktur und Funktion der PfGDH2 gewonnen sowie ein mögliches Zusammenspiel aller drei GDH-Isoenzyme des Malariaparasiten aufgezeigt werden. The development of resistance in the most important human malaria parasite, Plasmodium falciparum, against currently available drugs has been steadily increasing since the 1960s and has accounted for nearly 50 % of all deaths in the African population since the 1990s. For this reason it is of great importance to identify new target molecules and to develop novel and efficient antimalarials. The main goal of the present work was to characterize the glutamate dehydrogenases 2 and 3 from Plasmodium falciparum on a molecular level, in order to validate their suitability as drug targets. The focus was on the biochemical and structural characterization of the second glutamate dehydrogenase isoenzyme from Plasmodium falciparum. Cloning PfGDH2 constructs of varying lengths, heterologously overexpressing them and then separating the proteins via metal chelate affinity chromatography finally resulted in a catalytically active enzyme (truncated by 49 amino acids). Subsequently, the PfGDH2 protein was kinetically characterized.Furthermore the three-dimensional crystal structure of the apo form of the hexameric PfGDH2 protein was determined and examined at a molecular level. Superimposing this structure onto those of other GDH crystal structures showed great similarity in the secondary structure features, which correspond to the generally known structure of glutamate dehydrogenases in the S_50I family of various organisms. Also for PfGDH2 all amino acids that participate in the coordination of the substrates are highly conserved. In contrast to this however, the analysis of the monomer-monomer interactions showed significant differences in comparison to the first GDH isoenzyme of the parasite.Furthermore, studies to localize all three GDH proteins within the parasites via fusion proteins with the green fluorescent protein (GFP) were conducted.In silico analyses including virtual docking for structure-based drug discovery were conducted for both PfGDH1 and PfGDH2 as well as for human GDH and further validated the experimental data. Because of the size of the third PfGDH isoenzyme, this protein could not be experimentally studied. However, computer-based predictions indicated that PfGDH3 is likely to represent an NAD+-dependent glutamate dehydrogenase of the L_180 family, which forms hexamers in order to be catalytically active.Based on the results obtained in this thesis, new insights into structure and function of PfGDH2 were gained and the possible interactions between the three GDH isoenzymes of the malaria parasite were delineated.