Functional analysis of crosstalk in DNA mismatch repair

Abstract

Das DNA mismatch-Reparatur (MMR) System erkennt und beseitigt neben Replikationsfehlern auch jene DNA-Schäden, die bevorzugt durch das very short patch repair (VSPR) oder base excision repair (BER) System repariert werden. Aus diesem Grund gewährleisten nicht im Detail verstandene Mechanismen ein komplexes und koordiniertes Zusammenspiel (crosstalk) dieser Reparatursysteme, welche bei der Reparatur von DNA Schäden in vivo sowohl konkurrieren als auch kooperieren können. Da das MMR System eine wichtige Rolle bei zahlreichen Prozessen im DNA-Metabolismus spielt, ist es von Interesse zu verstehen, wie dieses Zusammenspiel reguliert wird und so gewährleistet werden kann, dass die DNA effizient repariert wird. Obwohl seit 25 Jahren erforscht, ist nur wenig darüber bekannt, wie das MMR System einen DNA Schaden an geeignete Effektor Proteine übergibt und dabei mit Komponenten potentiell konkurrierender Reparatursysteme funktionell interagiert.In der vorliegenden Arbeit wurde daher in vitro untersucht, ob und wie VSPR bzw. BER auf bedeutende Aspekte im Mechanismus des MMR Systems Einfluss nehmen und so das Zusammenspiel regulieren. So wurde analysiert, welche Auswirkungen die Anwesenheit eines konkurrierenden Systems auf die Funktionen des transient gebildeten damage sensor and signalling complex (MutSL Komplex) haben. Zu diesem Zweck wurden spezifische zirkuläre DNA Substrate und Reparatur Assays entwickelt, die es erlaubten die initialen Schritte von MMR, VSPR und BER in vitro zu rekonstruieren. Dadurch war es möglich, wechselseitige Einflüsse zweier um die Beseitigung eines DNA-Schadens konkurrierender Systeme zu analysieren. Da die Erkennung eines Schadens durch MutS den ersten Schritt bei MMR darstellt, wurde ebenfalls untersucht, ob und wie die Prozessierung eines DNA Schadens durch VSPR bzw. BER die mismatch Erkennung durch MutS beeinflusst.In dieser Arbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, auf welche Art und Weise MMR, VSPR und BER sich gegenseitig beeinflussen und so im crosstalk miteinander eine effiziente Reparatur gewährleisten. So stellte sich heraus, dass Vsr (VSPR), wie MutH und UvrD (MMR), zur Gruppe der Effektor Proteine gehört, die durch MutSL in einer mismatch und ATP abhängigen Reaktion aktiviert bzw. stimuliert werden (Kooperation). Dabei konkurrieren diese Effektor Proteine um die Rekrutierung und Aktivierung durch MutSL und somit um die Initiierung der Reparatur (Kompetition). Die erzielten Ergebnisse erklären die in vivo beobachtete funktionelle Beziehung zwischen MMR und VSPR und lassen vermuten, dass MutS, MutL und Vsr in E. coli ein Reparatur System (enhanced VSPR) bilden, welches eine effiziente Wiederherstellung des DNA Methylierungsmusters gewährleistet, auch wenn Vsr limitierend ist. Es wäre daher notwendig zu untersuchen, ob enhanced VSPR einen generellen Reparatur-Mechanismus darstellt, welcher auch in anderen Organismen existiert. Da ausgeschlossen werden kann, dass MutS und Vsr gleichzeitig an ein mismatch binden, unterstützen die hier erzielten Ergebnisse das Modell, bei dem MutS den zuvor erkannten Schaden in Form einer sliding clamp verlässt und anschließend ein transient mobiler MutSL Komplex je nach Bedarf anwesende Effektor Proteine rekrutiert und so die Reparatur einleitet. Dieses Modell wird auch dadurch unterstützt, dass MutH durch MutSL aktiviert wird, wenn ein DNA Schaden nur vier Basenpaare vom nächsten Strang Diskriminierungssignal entfernt ist.Das BER System verhindert ein unerwünschtes Prozessieren der DNA durch das MMR System, indem es die fehlerhafte Base (Uracil) aus der DNA entfernt. Obwohl die dabei entstehende abasic site (AP site) einen DNA Schaden darstellt, ist MutS entgegen den Erwartungen nicht in der Lage diesen Schaden zu erkennen. Somit können die Bildung des MutSL Komplexes und eine Aktivierung von Effektor Proteinen nicht erfolgen. Die Möglichkeit einen zuvor erkannten Schaden für MutS unkenntlich zu machen, kann zur funktionellen Analyse des multiple loading Models genutzt werden, welches beschreibt, wie das koordinierte Einleiten und Beenden von MMR gewährleistet wird.Um untersuchen zu können, ob MutS wie vermutet einen Schaden nach dessen Erkennen in Form einer sliding clamp wieder verlässt, wurden erste Versuche unternommen MutS während der mismatch-Bindung kovalent an die DNA zu koppeln und so den transienten MutS DNA Komplex für weitere funktionelle und strukturelle Studien einzufangen. Unter Verwendung der MutS Einzel-Cystein Varianten N468C und N497C sowie einem modifiziertem DNA Substrat war es möglich, transiente MutS DNA Komplexe mittels thiol spezifischem crosslinking einzufangen und so den mismatch Sensor an die Leine zu nehmen. Diese Komplexe konnten erfolgreich aufgereinigt werden und bilden somit einen optimalen Startpunkt für weitere funktionelle (z.B. ATPase Aktivität, DNA Biegung, Initiierung der DNA Reparatur) und strukturelle Studien (z.B. Kristallisation von MutS als sliding clamp) zur mismatch-Erkennung durch MutS. Beside the repair of various DNA lesions that appear during replication or recombination, the DNA mismatch repair (MMR) system recognizes and eliminates mismatches that are mainly repaired by the very short patch repair (VSPR) or base excision repair (BER) system. Consequently, precise but almost unknown mechanisms guarantee the complex and coordinated crosstalk between these pathways that can either compete or cooperate for repair of DNA mismatches in vivo. Considering the role of MMR in several processes of DNA metabolism, it is of interest to understand how this crosstalk in DNA mismatch repair is regulated in order to assure that DNA is repaired correctly and unfavoured or simultaneous repair processes are avoided. Although under investigation since over 25 years, discovering and monitoring how MMR proteins hand off damages or mismatches to suitable downstream repair factors and therefore interact with components involved in other DNA repair pathways remains still a significant challenge.Aim of this study was to investigate whether and how the VSPR and BER system affect MMR thereby regulating the crosstalk in DNA mismatch repair. For that reason, it was analyzed how these systems influence the functions of MutS and MutL as the transient damage sensor and signalling complex which plays the major role in damage signalling and recruitment of downstream repair factors. To this end, generation of suitable circular DNA substrates as well as development of specific DNA repair assays was required for reconstitution of initial steps in MMR, VSPR and BER in vitro and for subsequent investigations in mutual influences by these pathways during repair of a common target. In consideration of the fact that specific mismatch recognition and binding by MutS denotes the first step in MMR, it was additionally analyzed whether and how processing of mismatches during VSPR or BER influences mismatch recognition by the damage sensor MutS.The results achieved in this work reveal in which manner MMR, VSPR and BER affect each other during the crosstalk to assure that DNA is repaired efficiently. It turned out that Vsr (VSPR) belongs to the group of effector proteins such as MutH and UvrD (both MMR) that are recruited and activated in a mismatch and ATP dependent manner by the damage sensor and signalling complex (MutSL) (cooperation). However, these effector proteins also compete for recruitment and activation by the transient MutSL complex and consequently for initiation of repair (competition). The obtained results explain the observations made in vivo and the functional connection between MMR and VSPR suggests that MutS, MutL and Vsr build up a repair system (enhanced VSPR) that guarantees fast and efficient restoration of the DNA methylation pattern in E. coli when Vsr is limiting. The developed DNA repair assays permit to investigate whether enhanced VSPR is a general pathway also present in other organisms. Finally, the fact that binding of the same mismatch by MutS and Vsr simultaneously is mutual exclusive, the achieved results support the model in which MutS leaves the mismatch in form of a sliding clamp and a transient mobile MutSL complex recruits and activates downstream repair factors in order to initiate repair. This model is also supported by the fact that activation of MutH by MutSL is efficient when the DNA damage is only a few base pairs away from the next strand discrimination signal.In contrast to VSPR, the BER system in principle prevents misengaged procession of DNA by the MMR machinery via a rapid conversion of a U:G mismatch into a non mismatch due to release of the damaged base (uracil). Although the appearing abasic site denotes an important DNA lesion that is structurally similar to an IDL (insertion/deletion loop), surprisingly this damage is not recognized by MutS. Consequently, formation of the transient MutSL complex and subsequent activation of effector proteins resulting in misengaged procession of DNA will be avoided. The possibility to convert a mismatch into a non mismatch by BER might be useful for further functional studies of the multiple loading model that is used to explain how initiation and completion of MMR is achieved.To answer the question whether MutS indeed leaves a mismatch after recognition as a sliding clamp, it was attempted to couple MutS covalently to DNA while binding to a mismatch, thereby trapping the transient MutS DNA complex for further functional and structural studies. Using the single cysteine variants of MutS N468C and N497C as well as a modified DNA substrate it was possible to trap transient MutS DNA complexes via thiol specific site-directed crosslinking and therefore to put a leash on MutS. Both complexes were successfully purified and represent an optimal starting point for further functional (ATPase activity, DNA bending, initiation of MMR) and structural studies (crystallization of the sliding clamp) in mismatch recognition and signalling by MutS.