Osteogene Differenzierung von humanen Nabelschnurblutstammzellen (USSC) in der adhärenten Zellkultur sowie auf boviner, kollagener Knochenmatrix

Abstract

Der Einsatz von zellulären Transplantaten ist eine moderne und vielversprechende Alternative zu bisher bestehenden Therapiekonzepten bei der Behandlung von Knochendefekten. Das besondere Augenmerk liegt hierbei auf extrakorporal hergestellten Gewebekonstrukten, die in einen Defekt eingesetzt werden und einheilen können.In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential von humanen Nabelschnurblutstammzellen (USSC) evaluiert und eine Möglichkeit der Kultivierung dieser Zellen als Vorbereitung zum Einsatz in vivo untersucht. Desweiteren wurde das Potential des Trägermaterials Zytokine aufzunehmen und zu speichern sowie diese wieder abzugeben evaluiert. Mittels eines Trägermaterials eingebrachte Zytokine könnten sowohl körpereigene als auch transplantierte Zellen stimulieren. Für die osteogene Differenzierung der USSC wurden Dexamethason, Ascorbinsäure und ß-Glycerophosphat (DAG) sowie bone morphogenetic protein (BMP)-2 verwendet. Neben der Differenzierung im Monolayer wurden die Zellen auf einer kollagenen Knochenmatrix (ICBM) kultiviert und differenziert. Der Versuch der angiogenen Differenzierung der USSC wurde mittels vascular endothelial growth factor (VEGF) und Endothelial Growth Medium (EGM)-2 durchgeführt. Die charakteristischen Merkmale der osteogenen Differenzierung wurden auf RNA- und Proteinebene sowie phänotypisch anhand histologischer Färbungen und elektronenmikroskopischer Aufnahmen nachgewiesen. Die Merkmale der angiogenen Differenzierung wurden anhand des Transkriptionsprofils überprüft. Die Freisetzungskinetik von VEGF aus einem ICBM wurde mittels eines ELISA gemessen. Die ICBM wurden mit Zytokinen durch Trocknung oder durch eine Agarose/Gelatine-Beschichtung dotiert.Durch die Verwendung von DAG konnten die charakteristischen Merkmale der osteogenen Differenzierung anhand der genannten Methoden nachgewiesen werden. Der Einsatz von BMP-2 führte unter den angewandten Bedingungen jedoch zu keiner feststellbaren osteogenen Differenzierung der Zellen. Hier ist die Austestung dieses Zytokins in Kombination mit anderen Substanzen, wie beispielsweise einer zusätzlichen Phosphatquelle, erforderlich. Alternativ ist auch die Verwendung von anderen Zytokinkonzentrationen zu überdenken. Eine generelle Differenzierung der USSC zu knochenbildenden Zellen konnte sowohl im zwei- wie auch im dreidimensionalen Modell gezeigt werden. Die Expressionsprofile osteogener Marker unterscheiden sich in beiden Kulturen deutlich voneinander, wofür vor allem das 3D-Trägermaterial verantwortlich zu sein scheint. Der Versuch, osteogen und angiogen differenzierte Zellen desselben Ursprungs zusammenzuführen, gelang nicht, da es unter den gewählten Bedingungen nicht möglich war, die USSC in die endotheliale Linie zu differenzieren. VEGF ließ sich gut auf das spongiöse Gerüst des ICBM auftragen und durch eine Beschichtung des Trägers wurde eine retardierte Abgabe erreicht.Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die untersuchten USSC zur osteogenen Differenzierung geeignet sind. Insbesondere erscheint die Kombination der Zellen mit einem kollagenen Träger als ein vielversprechendes Konstrukt zur Knochenregeneration. Hingegen konnte unter den gewählten Bedingungen keine endotheliale Differenzierung der USSC induziert werden. Hier muss mithilfe weiterer Untersuchungen geklärt werden, ob die Zellen überhaupt ein Potential besitzen angiogen zu differenzieren. The application of cellular transplants is a modern and promising alternative to established therapeutic concepts for the regeneration of bone defects. Particular attention is paid to the production of extracorporeal manufactured tissue with the ability to grow in a defect.In this study the differentiation potential of human umbilical cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC) was evaluated and their cultivation prior to their application in vivo was determined. In addition, the potential of the scaffold to absorb and release cytokines was evaluated. Cytokines that are introduced on carrier materials may stimulate both cells of the surrounding tissue and those provided in the transplant.For the osteogenic differentiation of USSC dexamethasone, ascorbic acid and ß-glycerolphosphate (DAG) as well as bone morphogenetic protein (BMP)-2 were used. Additionally to the differentiation in monolayers the cells were cultivated and differentiated on an insoluble collagenous bone matrix (ICBM). The use of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endothelial growth medium (EGM)-2 was tested for angiogenic differentiation stimuli in USSC cultures. The characteristics of osteogenic differentiation were verified by the detection of upregulated osteogenic marker genes and proteins and also phenotypically by histological staining and electron microscopy. The characteristics of angiogenic differentiation were investigated through the determination of transcription profiles. The release kinetic of VEGF from ICBM was measured in an ELISA. ICBMs were coated with cytokines by drying or in an agarose/gelatin film.The methods used in this study provided evidence that DAG was capable of inducing the characteristics of osteogenic differentiation. Supplementation with BMP-2 did not result in detectable osteogenic cell differentiation Testing the cytokine in combination with other compounds serving as sources of phosphate and variation of cytokine concentrations will be required. Osteogenic differentiation of USSC in two-dimensional as well as in three-dimensional systems was demonstrated. The expression profiles of osteogenic markers vary significantly between the investigated models, which may be attributed to influences from the scaffold material. A combination of different lineages like osteogenic and angiogenic cells from the same source thus has to be reconsidered as soon as appropriate conditions for differentiation will be available. VEGF was readily applicable to the spongious structure of ICBM with characteristic release kinetics depending on the method of coating used.In summarizing the study, USSC is well qualified for osteogenic differentiation. In particular, the combination of cells and scaffolds is a promising construct for bone regeneration. With USSC a differentiation towards the endothelial lineage was not available under the conditions used. Future studies should clarify whether USSC have any inducible angiogenic potential.