Untersuchungen zum Einfluss des Extrazellulären Adhäsionsproteins von Staphylococcus aureus auf die Thrombozytenfunktion

Abstract

Thrombozyten nehmen eine ganz zentrale Position in der Blutgerinnung ein. Einerseits setzen sie infolge ihrer Aktivierung selbst Substanzen frei, die für den Hämostaseprozess sehr wichtig sind und diesen sekundär verstärken, z. B. Adhäsionsproteine, Gerinnungsfaktoren und Agonisten wie ADP oder TxA2. Andererseits stellen sie mit ihrer Zelloberfläche eine geeignete Reaktionsfläche für die Abläufe der Blutgerinnung dar und kontrollieren auf diese Weise sogar den Gerinnungsprozess, so dass dieser ausschließlich an den Ort der Verletzung lokalisiert wird. Diese Kontrollfunktion erreichen die Thrombozyten, indem sie die Gerinnungsfaktoren an ihrer Oberfläche binden. Zudem setzen sie neben den gerinnungsfördernden Proteinen auch gerinnungshemmende Substanzen frei, wie TFPI, Plasminogen, Protein C und Protein S. Zusätzlich zu ihrer zentralen Rolle in der Blutgerinnung besitzen die Thrombozyten wichtige Funktionen in der innaten Immunabwehr. Zum Beispiel besitzen sie toll-like-receptors , Fc- und Komplementrezeptoren auf der Zelloberfläche, an die Pathogene binden und somit die Thrombozyten aktivieren. Infolge der Aktivierung setzen die Plättchen unter anderem antimikrobielle Proteine und reaktive Sauerstoffspezies frei. Mit der Plättchenaktivierung wird natürlich auch die Gerinnungskaskade in Gang gesetzt, so dass die Pathogene im Folgenden durch Sequestration in den gebildeten Thromben aus der Zirkulation isoliert werden.Neben antimikrobiellen Proteinen und reaktiven Sauerstoffspezies setzen aktivierte Plättchen auch Zytokine, Chemokine und vasoaktive Substanzen frei, wodurch die Aktivierung und Chemoattraktion der Zellen verstärkt wird, die an Entzündungsreaktionen beteiligt sind.Sehr viele Keime und deren Proteine besitzen die Fähigkeit, Thrombozyten zu aktivieren. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit der Einfluss des Extracellular Adherence Protein (Eap) - gebildet von S. aureus - auf die Plättchenfunktion untersucht. Wie zahlreiche andere Proteine von S. aureus gehört Eap zu den Adhäsionsproteinen, welche die Bindung dieses Bakteriums an Wirtsstrukturen und -zellen ermöglichen, also den ersten essenziellen Schritt für eine erfolgreiche Infektion des Wirtsgewebes. Zudem wird die Zellinvasion von S. aureus, zum Beispiel in Epithel- und Endothelzellen, maßgeblich durch Eap vermittelt. Neben der Vermittlung der Zellinvasion moduliert Eap auch Entzündungsprozesse, indem es an ICAM-1 bindet und so die feste Bindung der Leukozyten an das Endothel und deren Transmigration ins entzündete Gewebe verhindert. Dieses kann bei Autoimmunerkrankungen jedoch durchaus Vorteile mit sich bringen, wie anhand einer experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis bewiesen wurde, deren Pathomechanismus mit dem der Multiplen Sklerose verglichen werden kann. Neben der Blockade der Leukozytentransmigration verschiebt Eap durch Modulation der Proliferation verschiedener T-Zellpopulationen das Gleichgewicht zwischen humoraler und zellulärer Immunantwort hin zur humoralen.In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das im Rahmen einer Sepsis in der Blutbahn vorkommende Eap die Thrombozytenfunktion beeinflusst. Einerseits wurde die Bindung von Fibrinogen-FITC stärker induziert, als es nach einer Inkubation mit Thrombin, Kollagen oder ADP der Fall war. Dagegen fiel allerdings die Sekretion der alpha-Granula eher mäßig aus. Die Degranulation der dense bodies konnte gar nicht durch Eap hervorgerufen werden. Die Eap-induzierte Plättchenaktivierung wurde somit nicht durch die Agonisten aus den dichten Granula sekundär verstärkt. Auch aggregierte Eap humane Thrombozyten. Rückschließend aus diesen Ergebnissen werden die verschiedenen Aktivierungsparameter scheinbar unterschiedlich stark durch Eap beeinflusst. Eap moduliert das Immunsystem auf zwei verschiedene Weisen, einerseits wird die innate Immunabwehr über die P-Selektin-PSGL-1-Verbindung zwischen Thrombozyten und Leukozyten stimuliert und die Transmigration der Leukozyten ins entzündete Gewebe durch Bindung von Eap an ICAM-1 gehemmt. Andererseits exprimieren die Plättchen infolge einer starken Aktivierung CD40L auf ihrer Oberfläche, wodurch die Stimulation der CD40-tragenden Immun- und Endothelzellen induziert wird; auch Eap konnte die CD40L-Expression auf der Thrombozytenoberfläche hervorrufen. Ob die CD40L-Expression auch zur Stimulation der T-Zellproliferation beiträgt, wie es von Haggar et al. (2005) beschrieben wurde, bleibt hier nur zu vermuten. Möglicherweise induziert Eap über die CD40L-CD40-Verbindung und die P-Selektin-PSGL-1-Verbindung auch die Bildung von Plättchen-Leukozytenassoziaten.Der Nachweis der prokoagulanten Thrombozytenoberfläche durch die Bindung von Annexin-V-FITC, FVIIa-FITC, FVIII-FITC und FXIII-FITC lässt den Rückschluss zu, dass die Anordnung der prokoagulanten Komplexe mit einer effizienten Thrombinbildung auf dieser Oberfläche durch Eap induziert wurde.Allerdings lässt sich aus den Ergebnissen der Antikoagulanzienversuche schließen, dass die Aktivierung, hier in Form der Fibrinogenbindung gemessen, unabhängig von sekundär gebildetem Thrombin und von Ca2+ stattfinden muss, da weder direkte Thrombininhibitoren noch Komplexbildner die Eap-induzierte Fibrinogenbindung an Plättchen hemmen konnten. Lediglich die Heparine konnten eine vollständige Hemmung bewirken.Außerdem wurden Versuche mit thiolreaktiven Substanzen durchgeführt, die bereits eine Hemmung der Plättchenaktivierung bewirkt hatten, die durch andere Agonisten induziert wurde. Es wurde deutlich, dass Eap die Thrombozyten in Abhängigkeit von oberflächlich frei zugänglichen Thiolgruppen aktiviert, da Thiolblocker, wie pCMPS und DTNB, sowohl die Fibrinogenbindung als auch die CD62P-Expression induziert durch Eap hemmen konnten. Im Gegensatz dazu können diese Thiolblocker bei der Plättchenaktivierung durch andere Agonisten, wie zum Beispiel Thrombin, nur die Fibrinogenbindung und Plättchenaggregation, nicht aber die Degranulation der Plättchen hemmen. Auch andere thiolreaktive Substanzen, wie Gliotoxin und PAO, hemmten die Eap-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.Die Protein Disulfid Isomerase (PDI) spielt bei der integrinvermittelten Adhäsion bzw. bei der Fibrinogenbindung eine entscheidende Rolle. Als solches moduliert sie den Redoxstatus von allosterischen Disulfidbrücken durch einen Disulfidaustausch, wodurch eine Konformationsänderung des Rezeptors nach Kontakt mit einem Agonisten induziert wird. Dadurch erreicht der Rezeptor eine stärkere Affinität für den Liganden, hier Fibrinogen. Der PDI-Hemmer Bacitracin konnte laut anderer Autoren die Agonisten-induzierte Fibrinogenbindung verhindern. Das gleiche erreichte Bacitracin bei der Eap-induzierten Aktivierung der Plättchen.Aufgrund der Erkenntnis, dass Eap mit freien Thiolgruppen interagiert, ließ sich auch eine mögliche Erklärung für die Heparinwirkung finden. Vermutlich spielt gar nicht so sehr die antithrombotische Wirkung der Heparine eine entscheidende Rolle, sondern vielmehr deren molekulare Struktur mit den zahlreichen Sulfatgruppen, mit denen Eap möglicherweise interagieren und so mit den Heparinmolekülen Komplexe bilden könnte.Neben der Untersuchung des Einflusses von Eap auf humane Thrombozyten wurde auch der Effekt von Eap auf Thrombozyten verschiedener Tierarten untersucht. Infolge einer Inkubation mit Eap ergaben sich sehr unterschiedliche Reaktionen bei den einzelnen Tierarten. Dies ist sicherlich zum Teil durch eine tierartspezifisch unterschiedliche Reaktivität der Plättchen begründet, wie zum Beispiel bei Pferden, die besonders im Zusammenhang mit Entzündungsreaktionen, wie bei einer Hufrehe oder Kolik, eine erhöhte Neigung zu thrombo-embolischen Komplikationen haben.Die Wiederkäuer besitzen dagegen eine sehr geringe Neigung zu derartigen Komplikationen. Das wurde auch in den Versuchsergebnissen dieser Arbeit deutlich und spiegelte sich in einer geringeren Reaktivität der Thrombozyten gegenüber verschiedenen Agonisten wider. Was Eap betrifft, ist der bisher noch nicht geklärte Aktivierungsmechanismus natürlich von entscheidender Bedeutung. Hier wurde vermutet, dass Immunglobuline möglicherweise, ähnlich wie bei anderen Staphylokokken-Adhäsionsproteinen, eine Schlüsselrolle spielen könnten, so dass die Thrombozyten der Ratte möglicherweise aufgrund einer stärkeren Antikörperproduktion, verglichen mit den anderen Tierarten und dem Menschen, in so viel stärkerem Maße aktiviert werden. Es bedarf noch einiger Untersuchungen, bis der genaue Mechanismus der Eap-induzierten Plättchenaktivierung geklärt werden kann. Die bisher erlangten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Aktivierung der Blutplättchen durch Rezeptoren oder Strukturen vermittelt wird, die oberflächlich frei zugängliche Thiolgruppen besitzen. Zudem ist bewiesen, dass MSCRAMMs, wie die fibrinogen- und fibrinonectinbindenden Proteine (FnBPs) und die Clumping Faktoren A und B (ClfA u. B), Plättchen über den FcgammaRIIA-Rezeptor aktivieren. Ebenso wie die Staphylokokken nutzen auch andere Bakterien wie Sc. pyogenes oder Sc. sanguis diesen Rezeptor, um die Thrombozyten mit entsprechenden oberflächlich exprimierten Proteinen zu aktivieren. Es läge also nahe zu überprüfen, ob auch Eap diesen Aktivierungsweg nutzt. Ob auf diesem Rezeptor oberflächlich Thiolgruppen frei zugänglich sind, wird in der derzeitig verfügbaren Literatur nicht genannt. Zudem könnten bei diesem Mechanismus tatsächlich IgGs eine vermittelnde Rolle spielen, ähnlich wie bei den anderen Adhäsionsproteinen von S. aureus, da der FcγRIIA-Rezeptor gleichzeitig auch der IgG-Rezeptor ist.Im Rahmen einer Sepsis ist Eap in der gesamten Blutbahn verteilt und kann durch seine Fähigkeit, die Plättchen zu aktivieren, zu einer disseminierten intravasalen Gerinnung führen. Erstens wird dadurch natürlich der Transport von Medikamenten, Nähr- und Abfallstoffen über die Blutbahn beeinträchtigt. Zweitens würde das bedeuten, dass die Keime in den Thromben vor Medikamenten und dem Immunsystem geschützt sind. Noch prekärer erscheint die Situation, wenn man bedenkt, dass gerade S. aureus immer mehr Resistenzen gegen sehr viele Antibiotika entwickelt, und wie schwer und folgenreich eine Sepsis mit S. aureus verlaufen kann (z. B. mit der Entwicklung einer Infektiösen Endokarditis und folgenden Herzklappeninsuffizienzen als bleibender Schaden).Angesichts dieser Tatsachen wird deutlich, wie wichtig die Suche nach neuen Therapieansätzen gegen eine Sepsis ist. Neben der Bekämpfung der Bakterien sollte auch die Prophylaxe/Behandlung gegen eine Plättchenaktivierung, bzw. gegen eine DIC, frühzeitig mit in die Therapiepläne einbezogen werden. Kann der Aktivierungsmechanismus, der durch Eap an Plättchen induziert wird, in Zukunft geklärt werden, würde man damit auch ein besseres Verständnis für die intrazellulären Signalwege der Thrombozyten gewinnen. Indem man mehr über diese intrazellulären Prozesse und die Pathogenese von Komplikationen in Verbindung mit einer Sepsis erfährt, wird man auch Ansätze für neue Therapiemöglichkeiten finden können. Platelets are the central and main mediators of haemostasis. On the one hand, they release substances in response to their activation, which are essential for the coagulation process, like adhesive proteins and coagulation factors, as well as agonists like ADP or TxA2 reinforcing the activation of the thrombocytes. On the other hand, they present a suitable surface for the coagulation process, where coagulation factors and agonists can bind. By binding these, the thrombocytes localize the coagulation to the place of injury, controlling this process and preventing an excessive coagulation in the vessel system.Additionally, they control the coagulation process by releasing inhibiting substances like TFPI, plasminogen, protein C and protein S.In addition to their central role in the coagulation process, they also possess abilities to communicate with cells of the innate and the specific immune defence system and with pathogens. For example, they have toll-like-receptors , Fc- and complement receptors on their cell surface by which pathogens get in contact with the thrombocytes and activate them. In response to their activation they release microbicidal proteins and reactive oxygen species to fight pathogens. Following the thrombocytic activation and secretion the pathogens are sequestered in a thrombus being eliminated from the circulation system.Beside microbicidal proteins and reactive oxygen species, thrombocytes also release cytokines, chemokines and vasoactive substances. By secreting these substances, thrombocytes activate cells of the innate immune defence system such as leukocytes. Since the activation and transmigration of leukocytes to inflamed tissue is essential for the inflammation process, thrombocytes thereby deliver an important contribution and reinforcement to the innate immune response. With the knowledge that many germs and associated proteins are able to activate thrombocytes, the experiments for this scientific work were focussed on the extracellular adherence protein (Eap) synthesized by S. aureus - and its effects on platelet function.As several other proteins released by S. aureus Eap belongs to the group of adhesion proteins. It enables this bacterium to bind to host tissues and cells, which is the first and essential step for a successful infection of host tissues. Beside the bacterial adhesion to host tissues it is also evident that invasion of S. aureus into endothelial and epithelial cells is mainly mediated by Eap. In addition, Eap is capable of modulating inflammation processes. By binding to ICAM-1, Eap inhibits the binding of leukocytes to these endothelial receptor and thereby the transmigration of leukocytes to the inflamed tissue. Beside the negative effect of this blockage, this can be a benefit in case of autoimmune neuroinflammatory disorders such as multiple sclerosis, where the pathomechanism of multiple sclerosis is inhibited by blocking the leukocytic transmigration. Another effect of Eap on the immune system is that it modulates the proliferation of distinct T-cell-populations in the way that the balance between cellular and humoral immune response is shifted towards the humoral defence.In this work it is shown that Eap can modulate platelet functions. It activates platelets, which can be characterized by fibrinogen binding. This is more intense after incubation with Eap compared to the binding intensity after incubation with thrombin, collagen or ADP. In contrast to that, secretion of the alpha-granules turned out to be rather poor after incubation of human thrombocytes with Eap and secretion of the dense bodies could not be detected. Therefore, Eap-induced activation was not secondarily enhanced by agonists of the dense bodies. Eap also aggregated human platelets.Hence, different platelet activation parameters were influenced by Eap unequally.In addition to the modulation of the innate immune response via the p-selectin-PSGL-1-connection and the inhibition of leukocytic transmigration via ICAM-1, there is still another factor making Eap an immune modulator. Incubated with Eap, thrombocytes express CD40L. CD40L on the platelet surface stimulates the immune and endothelial cells, which express CD40 on their cell surfaces. Therefore, the CD40L-expression on platelets might also stimulate the T-cell-proliferation as it was described by Haggar et al. (2005). It is quite possible that Eap induces the formation of associates between thrombocytes and leukocytes via the CD40L-CD40-connection and the P-selectin-PSGL-1-connection.The evidence of an Eap-induced procoagulant surface on thrombocytes detected by binding of FITC-conjugated coagulation factors and Annexin-V-FITC, leads to the conclusion that Eap induces the binding of procoagulant complexes to the cell surface and owing to this to a sufficient synthesis of thrombin on the platelet surface.But surprisingly, the experiments with anticoagulants show that the activation of thrombocytes - here detected by fibrinogen binding, takes place independently from thrombin or Ca2+. This can be concluded from the fact that neither thrombin inhibitors nor Ca2+-chelators can prevent platelet activation detected by fibrinogen binding. Just the group of heparines can block the Eap-induced platelet activation completely.In this work, also the effect of thiol reactive substances was assayed, which had shown an inhibition of platelet activation induced by known agonists like thrombin. So it is of great interest which effect they have on Eap-induced platelet activation.It was reported before that in case of platelet activation by known agonists thiol blocking substances like pCMPS or DTNB are only able to inhibit the binding of fibrinogen, but not granule secretion. That means the degranulation of platelets induced by known agonists occurs independently of free thiol groups on the receptors, whereas free thiol groups are necessary for the binding of fibrinogen. In contrast, the results of this work show that after incubation with Eap the thiol blocking substances inhibited the binding of fibrinogen to platelets as well as platelet degranulation.So there is a definitive dependency on free thiol groups on the platelet surface, not only for fibrinogen binding, but also for granule secretion. Additionally, the activation of platelets by Eap seems to be dependent on the protein disulfide isomerase (PDI) concluded from the experiments that have shown an inhibition of Eap-induced fibrinogen binding after incubation with the PDI-inhibitor bacitracin.Based on the knowledge that Eap reacts with free thiol groups there could be a possible explanation for the effect of the heparines. Probably it is not the antithrombotic effect of the heparines inhibiting the platelet activation induced by Eap, but much more their molecular structure with lots of sulphate groups that Eap possibly interacts with forming complexes with the heparine molecules.In addition to the effects of Eap on human thrombocytes, the effect of Eap on thrombocytes of different animal species was studied. Further experiments with blood samples from animals have shown that there is a great variation in the platelet reactions in response to Eap. This could possibly be explained by the fact that there is a species dependent different reactivity of platelets to the different agonists. Horses for example show a high tendency to thrombo-embolic complications, especially in connection with inflammation processes as found in case of colic or laminitis.In contrast, ruminants have been reported to have a very low tendency to those complications, which has also been reflected by a very low reactivity of ruminant platelets to different agonists in this work. Besides, the exact mechanism of platelet activation induced by Eap is not known yet. This could possibly imply further details to understand these differences in reactivity. We suppose that similar to other adhesion proteins of S. aureus immune globulins and the Fc-receptor could play a key role. It is therefore conceivable that a more intense production of antibodies in the rat compared to other species could induce a stronger activation of thrombocytes; or may be on the surface of rat platelets there are more receptors or structures expressed that Eap could interact with compared to platelets of other species. Further research is necessary to find out more about the mechanism of platelet activation induced by Eap. The results of this work indicate that Eap activates platelets via structures or receptors that possess accessible thiol groups on their surface.In addition it is evident that MSCRAMMs like the fibrinogen- and fibronectin binding proteins (FnBPs), the clumping factors A and B (Clf A and B) and the staphylococcal protein A (SPA) activate platelets via the FcγRIIA-receptor. Beside the staphylococcal bacteria several other bacterial species are known to activate platelets via this receptor, for example Sc. pyogenes or Sc. sanguis which also express adhesion proteins on their surface. So, obviously, in further experiments it should be checked out if Eap activates platelets via this receptor as well. In the present literature it is not mentioned if there are thiol groups on the Fc-receptor, which are accessible on its surface. Additionally, in case of activation via this receptor, immune globulins could have a mediating role indeed, since the Fc-receptor is the receptor for the immune globulins as well.In case of a sepsis, Eap is distributed over the whole circulation system. With its capability to activate platelets it can cause clot forming, so that the bacteria are sequestered in the clots being protected against the immune cells and medications; in worst case a disseminated intravasal coagulation (DIC) could be initiated. The situation seems to be still more precarious taking into account that S. aureus develops continuously more resistances to antibiotics and how heavy the course of a sepsis induced by S. aureus can be, for example by developing an infectious endocarditis that can result in a permanent heart deficiency. Based on these facts it becomes clear how important it is to find new therapeutic ways to fight septicaemia more successfully. In general, it is important not only to fight the bacteria, but also to do a prophylaxis, respectively a therapy against platelet activation and DIC. Further research on the effects of Eap on platelet function could lead to a better understanding of the intracellular processes of platelet activation caused by Eap. Gaining more detailed information about these mechanisms and the pathogenesis of complications in connection with a sepsis could yield to possible new therapeutic approaches.