Einfluss von Umweltsubstanzen auf die Spermatozoenfunktion

Abstract

Unfruchtbarkeit bei Mensch und Tier wird zunehmend der Belastung der Natur durch Schadstoffe zugeschrieben. Neben den vomMenschen in die Umwelt eingebrachten Chemikalien wird auch die alimentäre Aufnahme pflanzlicher Produkte diskutiert, die einen Einflussauf die Fertilität haben können. Genistein gehörtzur Gruppe der Phytoöstrogene deren Struktur denen von endogenen Östrogenen inMensch und Tier ähnelt. Diese Wirkstoffe konnten ubiquitär in der Pflanzenwelt, wie z. B. in Sojabohnen oder Hopfen nachgewiesenwerden. Ziel der Arbeit war es mit Genistein als Modellsubstanz ein valides und reproduzierbares in vitro Testsystem für den Nachweisnegativer Einflüsse von Umweltsubstanzen auf die Spermatozoenfunktion einzusetzen und die molekularen Mechanismen zu evaluieren, mitdenen Genistein die Funktion von Samenzellen beeinflusst. Als Testzellen wurden Rinderejakulate verwendet, die unter Zusatz desVerdünners AndroMed® eingefroren wurden; AndroMed® enthält im Gegensatz zu konventionellen Kryoprotektiva kein tierisches Eiweiß (i.d. R. Hühnereigelb). Es konnte gezeigt werden, dass AndroMed®-kryokonservierte bovine Spermatozoen als Testzellen für dieBestimmung von Spermatozoenfunktionen geeignet sind. Für sämtliche essenziellen Spermatozoenfunktionen konnten valide undreproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Somit wurden biochemische Untersuchungen erleichtert bzw. erst ermöglicht, weil keine imEinfriermedium befindlichen tierischen Eiweiße die Werte verfälschten. Es ist bekannt, dass Genistein die Bindung von Spermatozoen andie Zona pellucida hemmt. In der Arbeit konnte jetzt gezeigt werden, dass Genistein in vitro weder einen zytotoxischen Effekt aufRinderspermatozoen ausübt, noch die Beweglichkeit der Samenzellen beeinflusst. Auch verändert Genistein dasTyrosinphosphorylierungsmuster von Spermatozenproteinen während der Kapazitation nicht wesentlich. Die Wahl der Zellkulturmedien undkapazitationsfördernden Zusätze hatte einen Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung. Beim Vergleich von eingefrorenen und frischenSamenzellen fanden sich abhängig vom Kapazitationsmedium Unterschiede im Phosphorylierungsmuster. Im Chlortetracyclin-Assaykonnte gefunden werden, dass Genistein die Kapazitation von Spermatozoen nicht beeinflusst. Allerdings wurde bei den Untersuchungenzur Induzierbarkeit der Akrosomreaktion mit physiologischen Induktoren festgestellt, dass Genistein die mit Progesteron- oder ZP3-6Peptid-induzierte akrosomale Exozytose hemmt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass mit AndroMed® kryokonservierte Test-Spermatozoen dazu geeignet sindnachzuweisen, dass die hemmende Wirkung des Phytoöstrogens Genistein auf die Spermatozoen-Zona pellucida Interaktion nicht auf eineBeeinträchtigung der Vitalität, Motilität oder der Protein-Tyrosinphosphorylierung während der Kapazitation zurückzuführen ist, sonderneinen direkten Effekt auf Signaltransduktionsmechanismen hat, die an der Akrosomreaktion beteiligt sind. It has been suspected that certain synthetic chemicals and natural plant products may affect fertility adversely. These substances have beenassociated with reproductive problems in wildlife and in humans. Genistein, a phytoestrogen, belongs to a group of natural isoflavonespresent in e.g. soybean and hops. It has been identified in human and animal biological fluids and is present in foodstuffs. The objective ofthis study was to establish a valid and reproducible in vitro test system with genistein as a test substance to evaluate the effects ofenvironmental compounds on sperm functions and to evaluate which molecular mechanisms in spermatozoa are affected by thiscompound. Bovine spermatozoa cryopreserved with AndroMed® were used as test cells. In contrast to standard diluents, AndroMed®contains no proteins of animal origin such as egg yolk proteins. The results show that AndroMed®-cryopreserved bovine spermatozoa aresuitable test cells for the analysis of sperm functions. Reproducible results were obtained for all sperm functions tested. It is known thatgenistein can block the binding of spermatozoa to the zona pellucida. In the present study, it was demonstrated that genistein in vitro hasneither cytotoxic effects on bovine spermatozoa nor effects on sperm motility. In addition, the incubation of spermatozoa with genisteindoes not appreciably alter tyrosine phosphorylation of proteins during capacitation.The choice of medium and additives to promotecapacitation was found to have an influence on protein tyrosine phosphorylation. Comparing cryopreserved and fresh spermatozoadifferences in tyrosine phosphorylation were observed, when different capacitation media were applied. Using the chlortetracycline assay, itwas shown that genistein has no effect on sperm capacitation. However, in assessing of the inducibility of the acrosome reaction withphysiological inducers, it was determined that genistein inhibits progesterone- and ZP3-6 peptide-induced acrosomal exocytosis. In summary, we found that AndroMed®-cryopreserved sperm preparations are suitable for testing the effects of the phytoestrogengenistein. Furthermore, the inhibitory effect of genistein on the spermatozoa-zona pellucida interaction is not due to impairment of vitality,motility, or protein tyrosine phosphorylation, but rather to a direct effect on the signal transduction mechanisms involved in the acrosomereaction.