Die Degradation der organischen Dentinmatrix durch Pepsin unter erosiven Bedingungen in vitro

Abstract

Bei Patienten, bei denen durch einen chronischen Reflux oder durch eine Essstörung in Kombination mit regelmäßigem Erbrechen häufig Magensäure in die Mundhöhle gelangt, können zum Teil sehr ausgeprägte erosive Zahnhartsubstanzverluste festgestellt werden. Im Schmelz, der zum größten Teil aus mineralischen Anteilen besteht, kann hierfür die Erosivität der Salzsäure des Magens verantwortlich gemacht werden. Im Dentin allerdings sind Erosionsvorgänge durch den deutlich höheren organischen Anteil wesentlich komplexer. Verschiedene Autoren haben die Wirkung einer durch Säure exponierten Dentinmatrix als Diffusionsbarriere für Säuren beschrieben. Dentinerosionen schreiten nach enzymatischer Degradation dieser Barriere wesentlich schneller voran. In den genannten Patientengruppen gelangt neben der Magensäure auch Pepsin, ein Enzym, das Kollagen in zahlreichen Geweben degradieren kann, in die Mundhöhle. Es ist durchaus denkbar, dass das Pepsin der Magensäure in der Lage ist, die Dentinmatrix zu degradieren und so Dentinerosion zu beschleunigen. Dies könnte eine Erklärung für die teilweise schweren Erosionen im Dentin bei Patienten mit Erosionen endogener Herkunft sein. Ziel dieser In-vitro-Studie war es deshalb, den Einfluss von Pepsin auf die organische Dentinmatrix und die daraus resultierende Progression von Dentinerosionen zu untersuchen.Aus noch nicht in die Mundhöhle durchgebrochenen Weisheitszähnen wurden insgesamt 100 longitudinale Zahnschnitte mit einer Dicke von 750 µm hergestellt. Alle Proben entstammten dem koronalen Dentin. Die Proben wurden in eine Kontrollgruppe (Demineralisation in 8 ml HCl-Lösung pro Probe; pH 1,6) und drei Pepsin-HCl-Gruppen (1 ml (P-HCl-1), 4 ml (P-HCl-4) und 8 ml (P-HCl-8) Pepsin-HCl-Lösung pro Probe; pH 1,6; 750 µg/ml Pepsin) verteilt. Jede Gruppe enthielt 25 Proben. Die Proben wurden zyklisch de- und remineralisiert. Die Demineralisation der Proben aller Gruppen erfolgte 6-mal täglich für 5 Minuten in der entsprechenden Versuchslösung mit der entsprechenden Menge. Die Proben wurden zwischen den einzelnen Zyklen für mindestens eine Stunde in einer Remineralisationslösung gelagert. Der Mineralverlust der Proben wurde nach jedem Versuchstag mit der longitudinalen Mikroradiographie bestimmt. In den Pepsinlösungen der P-HCl-4-Gruppe wurde der Kollagengehalt mit der Hydroxyprolinanalyse täglich gemessen. Zusätzlich wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Bruchpräparaten von Proben angefertigt, die mit der Pepsin-HCl-Lösung beziehungsweise mit der HCl-Lösung behandelt worden sind.Am Ende des letzten Versuchstages konnte kein signifikanter Unterschied im Mineralverlust zwischen den Gruppen festgestellt werden (Kontrollgruppe: 133,0±35,3 µm, P-HCl-1-Gruppe: 87,9±21,7 µm, P-HCl-4-Gruppe: 142,0±22,5 µm, P-HCl-8-Gruppe: 128,7±66,0 µm; alle Vergleiche n.s.). Lediglich in der Initialphase der Studie war eine schnellere Progression in den Pepsin-HCl-Gruppen zu verzeichnen, die mit ansteigendem Lösungsvolumen zunahm. Der Mineralverlust nach dem ersten Tag betrug in der Kontrollgruppe 27,9±24,7 µm, in der P-HCl-1-Gruppe 33,4±17,1 µm (n.s. im Vergleich zur Kontrollgruppe), in der P-HCl-4-Gruppe 42,2±19,5 µm (n.s. im Vergleich zur P-HCl-1-Gruppe und zur Kontrollgruppe) und in der P-HCl-8-Gruppe 53,1±25,1 µm, (p=0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur P-HCl-1-Gruppe, n.s. im Vergleich zur P-HCl-4-Gruppe). Die Konzentrationen von Hydroxyprolin nahmen von Tag zu Tag ab, jedoch war der Unterschied zwischen den Hydroxyprolinkonzentrationen des ersten und des letzten Versuchstages statistisch signifikant (Reduzierung von Tag 1 zu Tag 5 um 1005±1280 ng, p=0,05). Rasterelektronenmikroskopisch konnte eine strukturelle Veränderung der Dentinmatrix der mit der Pepsin-HCl-Lösung behandelten Proben im Vergleich zu den mit der HCl-Lösung behandelten Proben festgestellt werden. Die organischen Anteile der mit der Pepsin-HCl-Lösung behandelten Proben waren nur teilweise entfernt worden und waren noch in beträchtlicher Menge auf den Oberflächen vorhanden. Sie erschienen aber insgesamt dichter und weniger strukturiert als bei den Proben der mit der HCl-Lösung behandelten Proben.Die Ergebnisse der Hydroxyprolinanalyse zeiegn, dass Kollagen zwar abgebaut wird, doch zeigen die mikroradiographischen Untersuchungen, dass die Progression von Dentinerosionen unter den genannten Bedingungen in vitro durch Pepsin nicht signifikant beschleunigt wird. Eine mögliche Erklärung dafür ist die unvollständige Degradation der Matrix durch Pepsin. Patients suffering from chronic reflux or eating disorders associated with regular vomiting, frequently have gastric acid present in the oral cavity. These patients often show erosive loss of dental hard tissues. In enamel, which is mainly composed of mineral, the low pH and the resulting high erosivity of the hydrochloric acid contained in the gastric juice is held responsible for causing erosion. In dentine, however, the processes of erosion are more complex, due to the higher content of organic material. The organic dentine matrix is exposed by the impact of acids, persists on the tooth surface and can act, as described by various authors, as a diffusion barrier for acids. After the enzymatic degradation of this barrier, dentine erosion progresses much more quickly.In the patient groups mentioned above together with the gastric acid proteolytic enzymes like pepsin, an enzyme able to degrade collagen in numerous tissues, can reach the oral cavity. It is quite conceivable that the pepsin in the gastric juice is able to degrade the dentine matrix and, thereby, accelerate dentine erosion. This might be an explanation for the sometimes severe dentine erosion in patients with erosion of endogenous origin. The aim of this in vitro study was, therefore, to investigate the effect of pepsin on the organic dentine matrix and on the progression of dentine erosion.A total of 100 longitudinal tooth sections with a thickness of 750 µm were prepared from the coronal dentine of human third molars which had not yet reached the oral cavity. The specimens were divided into four groups: a control group (demineralisation in 8ml HCl solution per specimen, pH 1.6) and three pepsin-HCl groups (1ml (P-HCl-1), 4ml (P-HCl-4) and 8ml (P-HCl-8) of pepsin-HCl solution (pH 1.6, 750 µg of pepsin per ml HCl) per specimen). Each group contained 25 specimens. The specimens were cyclically de- and re-mineralised. Demineralisation of the specimens of all groups was done 6 times per day for 5 minutes each, in the respective test solution with the appropriate quantity. Between cycles, the specimens were kept for at least one hour in a remineralisation solution. The mineral loss of the specimens was determined after each experimental day by longitudinal microradiography (LMR). In the pepsin solutions of the P-HCl-4 group, content of collagen degradation products was measured daily with hydroxyproline analysis. Additionally scanning electron microscopic (SEM) pictures were made of cross sections of specimens, treated either with the pepsin-HCl solution or with the HCl solution.At the end of the last experimental day, no significant differences in mineral loss were found between the groups (Control group: 133.0 ± 35.3 µm, P-HCl-1 group: 87.9±21.7 µm, P-HCl-4-group: 142.0±22.5 µm, P-HCl-8 group: 128.7±66.0 µm; all comparisons n.s.). Only in the initial phase of the study a faster progression was noted in the pepsin-HCl groups, which increased with an increasing volume of solution. Mineral loss after the first day was 27.9±24.7 µm in the control group, in 33.4±17.1 µm the P-CHl 1 group (n.s. compared to control group), 42.2±19.5 µm in the P-HCl-4 group (n.s. compared to P-HCl 1 or to control group). In the P-HCl 8 group, 53.1±25.1 µm (p=0.01 compared to control group or to p-HCl-1 group, n.s. compared to P-HCl 4 group). The concentration of hydroxyproline decreased from day to day. However, only the difference between the hydroxyproline concentration on the first and last day of the experiment was significant (reduction from day 1 to day 5 by 1005±1280 ng, p=0.05).The SEM-pictures showed a structural change within the dentine matrix in the specimens treated with the pepsin-HCl solution in comparison with those specimens treated with the HCl solution. The organic fraction was removed only partially by the treatment with the pepsin-HCl solution and was still present in considerable quantities on the surfaces. These structures were denser and less structured than in the specimens which had been treated with the HCl solution.The results of the hydroxyproline analysis show that collagen was indeed degraded by the enzyme. However, the results of the LMR-analysis showed that the progression of dentin erosion was not accelerated by pepsin treatment under the in vitro conditions used in the present study. The incomplete degradation of the matrix by pepsin could be an explanation for the lack of an increase of mineral loss.