Arabidopsis thaliana matrix metalloproteinases (MMPs) in plant defense against pathogens

Abstract

Matrix metalloproteinases (MMPs) are evolutionary conserved metal-dependent endopeptidases widely present in animals and plants. Mammalian MMPs are well known as central regulators in a number of physiological and pathological processes such as tissue remodeling and cancer progression. Little is known about the detailed function and molecular mechanisms of MMPs in plants. Main focus of the present study was to analyze the potential involvement of Arabidopsis MMPs family in plant immune responses. Phylogenetic analysis using 44 MMPs from fourteen higher plants resulted in a clear classification of four subgroups, which are associated with certain plant species or functions. The expression profiles of five At-MMPs were examined in Col-0 plants during the interaction with distinct microbes, including the biotrophic fungus Golovinomyces orontii, necrotrophic fungus Botrytis cinerea, hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000 and the symbiotic mycorrhizal-like fungus Piriformospora indica. At2-MMP and At3-MMP were clearly up-regulated after infection with Pst DC3000 as well as B. cinerea. This indicates a potential involvement of MMPs in pathogen resistance. Arabidopsis T-DNA insertion mutant lines were tested for altered resistance. Mutation of At4-MMP and At5-MMP did not exhibit clear changes in pathogen resistance. At2-MMP mutants were identified to be more susceptible to B. cinerea infection. In contrast, At2-MMP overexpression lines 35S::MMP2 showed enhanced resistance to B. cinerea. Moreover, 35S::MMP2 exhibited early flowering compared with control plants. At3-MMP showed similar altered responses as At2-MMP based on mutants and overexpression analysis. Double mutants at2-mmp/at3-mmp were produced and showed significantly enhanced susceptibility to B. cinerea. These results confirmed the essential role of At2- and At3-MMP in the resistance towards B. cinerea. Bombardment-mediated transient transformation was used to clarify the subcellular localization of At2-MMP. Plasmolysis experiments demonstrated that a MMP2-GFP fusion protein was co-present in the plasma membrane and apoplastic space. In addition, recombinant proteins for Pro-MMP2 and mature MMP2 (Mat-MMP2) were produced and tested for proteolytic activity. As a result, Mat-MMP2 exhibited substantially higher activity than Pro-MMP2 against the substrate myelin basic protein (MBP). Activities of MMP2 can be inhibited by the metal chelator EDTA. Like most mammalian MMPs tested, the recombinant At2-MMP protein showed no direct antimicrobial activity towards B. cinerea conidia spore germination and hyphae growth. Expression pattern of At2-MMP and At3-MMP in Col-0 was compared in mutants which are compromised in SA (NahG, ics1, npr1-1, PAD3), JA (jar1, jin1) or ET (ein2-1) signalling after B. cinerea infection. The similar induction of At2-MMP and At3-MMP in all the mutants suggested that B. cinerea-induced expression of At2/3-MMP was likely independent of SA, JA and ET signalling. Reactive oxygen species (ROS) are early host responses to pathogen infection. To decipher the mode of actions for At2- and At3-MMP mediated immune responses, the ROS production in 35S::MMP2, at2-mmp and at3-mmp mutants was monitored after treatment of pathogen-associated molecular pattern molecules (PAMPs, flg22, elf18 and chitin) and a danger- associated molecular pattern peptide (DAMPs, Pep1). Intriguingly, the PAMP/DAMP-triggered ROS production was largely impaired in 35S:MMP2 plants. Wild-type level of ROS generation was observed in at2-mmp mutants. In contrast, flg22 and chitin-induced ROS generation was enhanced in at3-mmp mutants. Preliminary data also indicated that recombinant At2-MMP protein was capable of inducing ROS production in Col-0 plants. Taken together, At2-MMP and At3-MMP are playing essential roles in Arabidopsis immune responses likely through the modulation of ROS production. Future studies are suggested to focus on their physiological substrates, mode of actions and roles in resistance to other pathogens such as bacterial pathogens. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind evolutionär konservierte metall-abhängige Endopeptidasen, die in tierischen und pflanzlichen Organismen weit verbreitet sind. Säugetier MMPs sind zentrale Regulatoren in einer Reihe von physiologischen und pathologischen Prozessen, wie Auf- und Abbau von Gewebe und Tumorwachstum. Über die genauen Funktionen und molekularen Mechanismen pflanzlicher MMPs ist dagegen wenig bekannt. Ziel der folgenden Arbeit war daher die Analyse der potentiellen Rolle der Arabidopsis MMP Proteinfamilie bei der pflanzlichen Abwehr.Phylogenetische Analysen mit 44 MMPs aus 14 Pflanzenarten ergaben eine klare Einteilung der Proteine in vier Untergruppen, die jeweils mit spezifischen Beschaffenheiten oder Funktionen korreliert werden können. Von den fünf Arabidopsis At-MMPs wurden die Expressionsprofile während der Interaktion von Col-0 Pflanzen mit ausgewählten Mikroorganismen untersucht. Hierzu wurden der biotrophe Pilz Golovinomyces orontii, der nekrotrophe Pilz Botrytis cinerea, das hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000 und der symbiotische, Mykorrhiza-ähnliche Pilz Piriformospora indica verwendet. Bei At2-MMP und At3-MMP wurde nach Infektion mit Pst DC3000 und B. cinerea eine deutlich gesteigerte Expression beobachtet. Dies weist auf eine mögliche Rolle der MMPs in der Pathogenabwehr hin. Mehrere Arabidopsis T-DNA Insertionslinien wurden daraufhin auf eine veränderte Resistenz gegnüber B. cinerea getestet. Eine Mutation von At4-MMP und At5-MMP zeigte keine signifikanten Änderungen in der Pathogenabwehr. At2-MMP Mutanten waren dagegen suszeptibler gegenüber dem Pilz. Im Gegensatz dazu wiesen At2-MMP Überexpressionslinien (35S::MMP2) eine erhöhte Resistenz gegen B. cinerea auf. Zusätzlich wurde bei diesen Pflanzen eine frühere Blütenbildung als bei Kontrollpflanzen beobachtet. In Mutations- und Überexpressionlinien von At3-MMP wurden ähnliche Phänotypen wie für At2-MMP festgestellt. Deshalb wurden at2-mmp/at3-mmp Doppelmutanten generiert. Diese wiesen eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber B. cinerea auf. Die Ergebnisse bestätigen eine essentielle Rolle von At2- und At3-MMP in der Resistenz gegen B. cinerea. Transiente Expression mittels Particle-Bombardment wurde verwendet um die subzelluläre Lokalisation von At2-MMP zu studieren. Plasmolyse Experimente ergaben eine duale Lokalisation des Proteins an der Plasmamembran und dem apoplasmatischen Raum. Zusätzlich wurde rekombinantes Proenzym Pro-MMP2 und prozessiertes MMP2 (Mat-MMP2) hergestellt und auf proteolytische Aktivität getestet. Mat-MMP2 zeigte eine substantiell höhere Aktivität gegenüber dem Substrat Myelin-Basisches Protein (MBP), als Pro-MMP2. Die Aktivität von MMP2 ist durch den Metallchelator EDTA inhibierbar. Wie die meisten getesteten Säugetier MMPs wies rekombinantes At-MMP2 keine direkte antimikrobielle Wirkung gegenüber Sporenkeimung und Hyphenwachstum von B. cinerea auf. Die Expressionsmuster von At2-MMP und At3-MMP in Col-0 Pflanzen nach Infektion mit B. cinerea wurden mit denen in Mutantenlinien verglichen, die eine gestörte SA (NahG, ics1, npr1-1, pad3), JA (jar1, jin1) oder ET (ein2-1) Signalweiterleitung aufweisen. Die mit dem Wildtyp vergleichbare Induktion von At-MMP2 und At3-MMP in allen Mutanten weist darauf hin, dass die B. cinerea induzierte Expression dieser Proteine wahrscheinlich unabhängig von SA, JA und ET Signalwegen erfolgt. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gehört zu den frühen Abwehrreaktionen von Pflanzen. Ziel war es, die Rolle von At2-MMP und At3-MMP bei der pflanzlichen Abwehr genauer zu untersuchen. Hierzu wurde die ROS Produktion in 35S:MMP2, at2-mmp und at3-mmp Pflanzen nach Behandlung mit microbe-associated molecular patterns (MAMPs, flg22, elf18 und chitin) und danger-associated molecular patterns (DAMPs, Pep1) untersucht. Interessanterweise zeigten 35S:MMP2 Pflanzen eine deutlich verringerte ROS Produktion als Antwort auf die MAMP/DAMP Behandlung. Kein Unterschied zum Wildtyp konnte in at2-mmp Mutanten beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigten at3-mmp Pflanzen eine erhöhte Produktion von ROS als Reaktion auf flg22 und Chitin. Vorläufige Daten deuten zusätzlich darauf hin, dass rekombinantes At2-MMP Protein selbst zur Produktion von ROS in Col-0 Pflanzen führt. Zusammengefasst spielen die Matrix-Metalloproteasen At2-MMP und At3-MMP wichtige Rollen bei Immunreaktionen in Arabidopsis, wahrscheinlich durch die Modulation der ROS Produktion. Zukünftige Studien sollten auf die Substrate der At-MMPs, ihre genaue Funktionsweise und ihre Beteiligung an Reaktionen gegenüber anderen Pathogenklassen, wie zum Beispiel Bakterien, abzielen.