Autoimmunity in complex regional pain syndrome

Abstract

Complex regional pain syndrome (CRPS) is a painful condition affecting one ormore extremities of the body, marked by a wide variety of symptoms and sings thatare often difficult to manage since pathophysiology is incompletely understood.Thus, diverse treatments might be ineffective. A recent report revealed thepresence of autoantibodies against nervous system structures in CRPS patients.However it remained unclear how the antibodies act in the development of CRPS.We therefore aimed to characterize these antibodies and identify target antigens.Sera of CRPS patients, neuropathy patients and healthy volunteers were tested forsurface-binding autoantibodies to primary cultures of autonomic neurons and manydifferentiated neuroblastoma cell lines using flow cytometry. Further, functionalproperties of affinity-purified IgG of controls or CRPS patients were assessed usinga cardiomyocyte bioassay. Putative receptors and target antigens were identifiedusing antagonistic drugs and synthesized peptides sequences corresponding tosegments of these receptors. Peptides were also used to establish an enzymeimmunoassay. Antibodies were tested in stable transfected CHO cells with putativereceptors to ensure observed binding. Further, changes in the intracellular Ca2+concentration induced by agonistic IgG were measured using the Ca2+-sensitivefluorescent dye fura-2 assay. Potential cytotoxicity of binding antibodies weretested using LDH and WST-1 assay.13/30 CRPS patients, but none of 30 healthy controls and only one out of 20neuropathy sera had specific surface-binding to autonomic neurons. The majorityof the sera reacted with both sympathetic and myenteric plexus neurons. Thedifferentiation of SH-SY5Y into a cholinergic phenotype induced a surface-antigen,which is recognized by 60% of CRPS sera (18/30), but not by controls. Moreover,ELISA and an established cardiomyocyte assay demonstrated the presence ofautoantibodies in most CRPS patients with agonistic-like properties on the ß2ARand M2R. We identified these autoantibodies as immunoglobulin G directedagainst peptide sequences from the second extracellular loop of these receptors.Though antibodies acted on receptors and increase in intracellular Ca2+concentration in transfected cells, they were not able to induce receptordownregulation, desensitization or cytotoxicity.The recent detection of functionally active autoantibodies in serum samples fromCRPS patients against cell-surface determinants of sympathetic, myenteric anddifferentiated autonomic nervous system neurons, and the identification of thesedeterminants as part of ß2AR or M2R expressed in these cells suggested anautoimmune mechanisms as one important pathogenic factor in thepathophysiology of CRPS. Thus, our findings contribute to the understanding ofthis disease, could help in the diagnosis in future, and encourage new treatmentstrategies focusing on the immune system. Das komplexe regionale Schmerzsyndrom gehort zur Gruppe der chronischposttraumatischen Schmerzsyndromen. Die Krankheit ist gekennzeichnet durchregionale, persistierende neuropathische Schmerzen mit sensorischen-, vaso-,sudomotorischen-, motorischen- und trophischen Veranderungen nach ausererEinwirkung (z. B. Traumen, Operationen und Entzundungen). Da derzugrundeliegende Pathomechanismus des CRPS noch nicht eindeutig geklart ist,sind die Symptomenkomplexe therapeutisch nur symptomatisch beeinflussbar.Unserer Gruppe gelang erstmals der Nachweis von Autoantikorpern gegenStrukturen des autonomen Nervensystems bei Patienten mit CRPS. Bis heutewurde jedoch noch nicht untersucht, in wie weit diese Antikorper eine Rolle bei derEntstehung des CRPS spielen konnten. Das Ziel der vorliegend Arbeit war dieCharakterisierung dieser Antikorper, sowie die Identifizierung der zugehorigenAntigene.In der hier vorgestellten Studie untersuchten wir Seren von gesunden Probanden,CRPS- und Polyneuropathie-Patienten auf das Vorliegen relevanter Autoantikorpergegen Oberflachenepitopen primarkultivierter autonomer Neuronen unddifferenzierter Neuroblastom-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Daruber hinausuntersuchten wir mogliche funktionelle Effekte antineuronaler Autoantikorper imBioassay der spontan pulsierenden neonatalen Rattenherzmuskelzellen. ZurIdentifizierung der Bindungsrezeptoren bzw. Bindungsepitops untersuchten wir denEffekt von Rezeptoren-Antagonisten und von kurzen uberlappenden Peptiden derextrazellularen Schleife verschiedener Rezeptoren. Diese Peptide derextrazellularen Schleife autonomer Rezeptoren wurden zur Etablierung einesELISA-Assay verwendet. Zur Bestatigung der Bindungseigenschaften derAutoantikorper wurden stabil transfizierte CHO-Zellen mit Bindungsrezeptorendurch Anwendung der Durchflusszytometrie und Imaging-(Fura-2)-Technikgetestet.Bei 13/30 CRPS-Patienten aber nur bei 1/20 Patienten mit Polyneuropathie undbei keiner Kontrolle konnte die Bindung von IgG an der Oberflacheprimarkultivierter autonomer Neuronen durchflusszytometrisch nachgewiesenwerden. Die meisten Seren reagierten sowohl mit Neuronen aus sympathischenGanglien, wie auch kultivierten Darmplexusneuronen. 18/30 der CRPS- aber keineKontroll-Seren erkannten eine Epitop erzeugt durch Differenzierung von SY5Y zumcholinergischen Phanotyp. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Mehrheit derCRPS-Patienten stimulierende Antikorper gegen À2AR und M2R aufweisen. DerNachweis der Autoantikorper erfolgte mittels ihres chronotropen Effekts auf diePulsationsrate der Herzmuskelzellen sowie dessen Blockierung durch denadrenergen À2-Blocker, den M2-Antagonist und synthetische gegen die 2.extrazellulare Schleife der beiden Rezeptoren gerichtete Peptide. Diese Datenwurden durch erhohte Bindung patogenischer Antikorper zu der Oberflache À2ARund M2R transfizierter Zellen bestatigt. Obwohl durch die Imaging-(Fura-2)-Technik der stimulierende Antikorpereffekt wieder bestatigt wurde, fuhrte keineuntersuchte IgG-Fraktionen von CRPS-Patienten zu zellbiologischenVeranderungen wie Zytotoxizitat oder Rezeptor-Desensitisierung bzw. -Downregulation.Die von uns nachgewiesenen funktionellen Effekte antineuronaler Autoantikorpervon CRPS-Patienten gegen primarkultivierter und differenziert autonomerNeuronen und der Charakterisierung stimulierender Autoantikorper gegenPeptiden der zweiten extrazellularen Schleife der À2AR und M2R deutet daraufhin, dass Immunmechanismen in der Pathogenese des CRPS, moglicherweisedurch eine Autoimmunreaktion gegen das autonome Nervensystem eine wichtigeRolle spielen konnten. Unsere Erkenntnisse bieten einen Einblick in moglichepathophysiologische Mechanismen bei der Entstehung von CRPS. Sie konnten alsBasis fur neue Uberlegungen uber diagnostische Methoden und den Einsatzimmunmodulierender Therapiestrategien dienen.