Einfluss des Calcium-aktivierten Kaliumkanals auf die Lysophosphatidylcholin induzierte Monozytenadhäsion an humanen Endothelzellen

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob die Lysophosphatidylcholin(LPC) induzierte Aktivierung des BKCa an der Monozytenadhäsion von U937-Zellenan humanen Nabelschnur Endothelzellen (HUVEC) beteiligt ist.Dabei wurde der Einfluss des BKCa auf das Membranpotential mit demFluoreszenzfarbstoff DiBAC gemessen. Die calcium- und radikalabhängige Adhäsionwurde mit Hilfe des 3[H]-Thymidin-Adhäsions-Assays untersucht. Die calcium- undradikalabhängige Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM wurde mitHilfe der Durchflusszytometrie gemessen.LPC induzierte eine konzentrationsabhängige Hyperpolarisation von HUVEC miteinem Maximum bei 20 myM. Weitere Konzentrationserhöhungen zeigten hierbeikeinen steigernden Effekt. Deshalb wurden alle weiteren Versuche mit einerKonzentration von 20 myM durchgeführt. Der hoch spezifische BKCa-InhibitorIberiotoxin (IBX) konnte die Hyperpolarisation verhindern (IBX, 100 nM). Dies deutetdarauf hin, dass dieser Ionenkanal für die Hyperpolarisation der Zellmembranverantwortlich ist.Es konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion von unstimulierten U937-Zellen durchStimulation der HUVEC mit LPC verstärkt werden konnte. Dieser Effekt war zeitlichabhängig und nach t=4 Stunden gegenüber der Kontrolle signifikant. Die Stimulationvon U937-Zellen führte nicht zu einer Steigerung der Adhäsion an unstimuliertenHUVEC. Dies deutet darauf hin, dass die Adhäsion hauptsächlich von endothelialerSeite auszugehen scheint. Die LPC induzierte Adhäsion konnte signifikant verringertwerden, wenn die HUVEC mit IBX, beziehungsweise dem NADPH-Oxidase-InhibitorDiphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) koinkubiert wurden. Ebenfalls verringerte dieHemmung der intrazellulären Calciumkonzentration durch den Calciumkanalblocker2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) sowie den Calciumchelator BAPTA(10 myM) die LPC induzierte Adhäsion signifikant. In den FACS-Versuchen konnteLPC die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM signifikant steigern.Durch Zugabe von IBX, DPI und BAPTA wurde die Expression von ICAM und VCAMebenfalls signifikant verringert.Zusammenfassend kann man sagen, dass die zeitabhängige Adhäsion sowie dieExpression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM von der intrazellulärenCalcium- und Radikalkonzentration abhängig sind und diese vom BKCa reguliertwerden. Aim of this study was to investigate whether LPC-induced activation of BKCa is alsoinvolved in monocyte adhesion of U937-cells to human umbilical cord endothelialcells (HUVEC). Therefore the influence of BKCa to membrane potential wasmeasured with DiBAC-fluorencence-dye. The calcium and ROS-dependent adhesionwas examined by using the 3[H]-thymidine-adhesion-assay. The calcium and ROSdependentexpression of adhesion molecules ICAM and VCAM was analysed withflow-cytometry.LPC induced a hyperpolarization of HUVEC in a dose-dependent manner with themaximum of 20 myM. Higher doses of LPC did not further enhance hyperpolarization.For this reason all following experiments were performed using a concentration of 20myM. The highly specific BKCa-inhibitor Iberiotoxin (IBX) prevented hyperpolarisation(IBX, 100 nM). This indicates that this ion channel is responsible forthe hyperpolarization of the cellmembrane.Adhesion of untreated U937 cells to HUVEC was increased after stimulation ofHUVEC with LPC. This effect was time-dependent with a maximum observed aftert=4 hours. On the other hand, stimulation of U937 cells with LPC did not causeenhancement of adhesion to unstimulated HUVEC. This indicates that the process ofadhesion is mainly caused by endothelial cells. LPC-induced adhesion wassignificantly reduced when HUVEC were co-incubated with IBX, NADPH-oxidaseinhibitor diphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) or by addition of calcium channel-blocker2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) or the calcium-chelator BAPTA (10myM) to reduce intracellular calcium concentration.In FACS analyses LPC enhanced the expression of adhesion molecules ICAM andVCAM. In Addition to LPC IBX, DPI and BAPTA significantly decreased ICAM andVCAM expression.In conclusion the experiments demonstrate that time-dependent adhesion as well asthe expression of adhesion molecules ICAM and VCAM depends on intracellularconcentration of calcium and reactive oxygen species which are regulated by BKCa.