Untersuchungen zum Proteom humaner lysosomaler Membranproteine sowie zum Niemann-Pick Typ C-1 Protein

Abstract

Von den Proteinen der lysosomalen Membran sind bisher nur wenige bekannt. Dies steht in einem gewissen Gegensatz zu den vielfältigenspezifischen Transportaufgaben der lysosomalen Membran. Ein genetischer Defekt eines für die Aufrechterhaltung des lysosomalenSystems verantwortlichen Proteins führt zur Ausbildung einer lysosomalen Speicherkrankheit. Ein Beispiel hierfür ist die Niemann-Pick TypC-1 Krankheit. Bei allen bisher identifizierten lysosomalen Membranproteinen handelt es sich um Glykoproteine. Bisher wurden gezielt nur einzelneProteine untersucht, nie aber das Proteom der lysosomalen Membranproteine zweidimensional aufgetrennt und charakterisiert. In dervorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass zur Trennung eines Gemisches lysosomaler Membranproteine die isoelektrischeFokussierung in Röhrchengelen mit Trägerampholyten eine deutlich bessere Ausbeute und Auftrennung lysosomaler Membranproteineerzielt werden kann, als bei der Verwendung immobilisierter pH-Gradienten. Besonders deutlich ist dies bei Proteinen mit einemMolekulargewicht höher als 30 kDa und einem isoelektrischen Punkt größer als pH 6.0. Mit Hilfe der vorliegenden, etablierten Methode istes möglich, bis zu 500 µg lysosomalen Membranproteins zu lysieren und in einem Bereich von pH 4.0 bis 7.0 zweidimensionalaufzutrennen. Die reifen lysosomalen Membranproteine weisen ein Molekulargewicht von etwa 10 kDa bis über 200 kDa auf. Eine Natriumcarbonat-Behandlung der lysosomalen Membranproteine zeigte, dass über 90 % der Proteine im Niederschlag zu finden sind.Einige Membranproteine konnten sowohl im Niederschlag als auch im Überstand detektiert werden. Es handelt sich hierbei um periphereMembranproteine. Es konnte gezeigt werden, dass weniger als ein Viertel der immunoaffinitätsgereinigten lysosomalen Membranproteine glykosyliert sind.Hiervon tragen über 80 % Neuraminsäuren und schätzungsweise 40 % N-glykosidisch verknüpfte Oligosaccharidseitenketten. Über 35 %der detektierten glykosylierten lysosomalen Membranproteine tragen sowohl N-Glykane als auch Neuraminsäuren. Das im Western-Blot nachgewiesene lysosomal assoziierte Membranprotein-2 (LAMP-2) ist im Anschluss an dieNatriumcarbonat-Behandlung im Niederschlag zu detektieren, trägt sowohl N-Glykane als auch Neuraminsäuren, weist ein apparentesMolekulargewicht von 100 bis 110 kDa auf und hat einen isoelektrischen Punkt von pH 4.2 bis 4.7. In der aus humaner Plazenta isolierten lysosomalen Membran konnte das so genannte Niemann-Pick Typ C-1 Protein (NPC-1) mittelsWestern-Blotting nachgewiesen werden. Das reife Protein kommt in zwei Formen vor und hat ein Molekulargewicht von 173beziehungsweise 204 kDa. Die Behandlung mit Peptid N-Glycosidase F führt zu einer Reduktion des Molekulargewichts beider Formenauf 151 kDa. Untersuchungen zum Vorkommen des NPC-1 im Verlauf des Percoll®-Gradienten zeigten, dass dieses Membranprotein nicht nur in denschweren Fraktionen des lysosomalen Kompartiments, sondern auch in leichteren Fraktionen des Gradienten, dem so genanntenendosomal/lysosomalen Kompartiment detektiert werden konnte. Die schweren lysosomalen Membranen weisen im Vergleich zu den leichten lysosomalen Membranen einen relativ höheren Cholesterol-und Sphingomyelingehalt auf. Die Phospholipide bilden die stärkste Lipidgruppe der Lysosomen. Hiervon ist der häufigste Vertreter dasPhosphatidylcholin. Bezogen auf das jeweilige Ausgangsmaterial liegt das Verhältnis des Cholesterols zu den Phospholipiden der leichtenFraktionen bei 0.26 und der schweren Fraktionen bei 0.44. Die zweidimensionale Auftrennung immunoaffinitätsgereinigter Membranen der schweren und leichten Fraktionen des Percoll®-Gradientenzeigt eine sehr große Übereinstimmung im Muster des jeweiligen Proteoms.