Untersuchungen zur Bindung von Galektin-1 an testikuläre Zellen

Abstract

Glycans linked to cell surface proteins encode a multitude of biological information decoded by specialized proteins termed lectins. Understanding this glycan based language and downstream signalling is of emerging significance due to research of the past two decades pointing at a large impact on regulating immune responses and maintenance of self-tolerance.Galectin-1 is a 14.5 kDa lectin conserved across species, which binds galactose ß1-4 N-acetylglucosamine containing oligosaccharides on the surface of immune and stromal cells. Its functional capability ranges from induction of T cell apoptosis, a shift of immune reactions from TH1 to TH2 and expansion of regulatory T cells (Tregs) to modulation of monocyte and macrophage functions. With its anti-inflammatory properties revealed in animal models of autoimmunity and chronic inflammation such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and experimental autoimmune uveitis (EAU), galectin-1 has emerged as a factor of clinical significance.In view of the immune privileged status of the testis, we hypothesised that galectin-1 could play a role in maintaining the immunosuppressive phenotype of this organ. As a first step, human galectin-1 C2S was recombinantly expressed, purified, labelled with Alexa Fluor 647 and its binding was investigated by immunohistochemistry using testicular cryosections. In a second step, isolated testicular macrophages, Sertoli and peritubular cells as important cells of testicular innate immunity were used to test their binding capacity of galectin-1 by flow cytometry.It was shown that all investigated testicular cell types are able to bind galectin-1, albeit with different intensity. The fluorescence signal of Alexa Fluor 647 conjugated galectin-1 C2S binding to peritubular and Sertoli cells is comparable to that of phytohaemagglutinin (PHA) stimulated mononuclear cells as positive control. In contrast galectin-1 binding to testicular macrophages is much weaker with an intensity lower than unstimulated mononuclear cells. The specificity of binding was verified by co-incubation with lactose or sucrose, respectively.In order to examine the phenotype of cell surface glycans, which mediate the affinity of galectin-1 for the respective cells, we applied a new set of plant lectins (MAA, LEA, PNA, SNA-I) in the analysis of isolated testicular cells by flow cytometry.It was found that reduced binding of galectin-1 to testicular macrophages in comparison to Sertoli and peritubular cells could result from a high degree of terminal a2-6 sialylation in cell surface glycans of testicular macrophages a regulatory mechanism known to modulate susceptibility of TH1 and TH2 cells to galectin-1 induced apoptosis.In summation, it is concluded from these studies that peritubular cells and Sertoli cells are the primary target cells for galectin-1 amongst the investigated cell types in the testis, but surprisingly not testicular macrophages. It seems likely that galectin-1 contributes to the testicular immune privilege mainly by interaction with testicular somatic cells. Mit Zelloberflächenproteinen verbundene Glykane enthalten eine Vielzahl biologischer Informationen, die durch spezifische Bindepartner, die Lektine, gebunden und erkannt werden. Das Verständnis dieser auf Glykanen basierenden Sprache und ihrer nachfolgenden Signalwege hat in den letzten zwanzig Jahren zunehmende Bedeutung erlangt und schließt Prozesse wie die Regulation der Immunantworten und Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz mit ein.Bei Galektin-1 handelt es sich um ein 14,5 kDa großes, über Artengrenzen hinweg konserviertes Lektin, welches Galactose-ß-(1->4)-N-Acetylglucosamin enthaltende Oligosaccharide auf der Oberfläche von Immun- und Stromazellen bindet. Seine Fähigkeiten reichen von der Induktion der Apoptose in T-Zellen, der Verschiebung von TH1- zu TH2-Immunantworten über die Vermehrung regulatorischer T-Zellen bis hin zur Modulation der Funktion von Monozyten und Makrophagen. Galektin-1 ist dabei von klinischer Bedeutung, da seine antientzündlichen Eigenschaften in Tiermodellen autoimmunologischer Erkrankungen und chronischer Entzündungen wie z. B. in experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis und experimenteller Autoimmunuveitis nachgewiesen wurden.Mit Blick auf die immunologisch privilegierte Stellung des Hodens vermuteten wir, dass Galektin-1 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des immunsuppressiven Phänotyps dieses Organs spielen könnte. In einem ersten Schritt wurde daher humanes Galektin-1 C2S rekombinant exprimiert, welches aufgereinigt und mit Alexa Fluor 647 markiert wurde. Anschließend untersuchten wir seine Bindung an Kryostatschnitte des Hodens in der Immunhistochemie. In einem zweiten Schritt wurden isolierte testikuläre Makrophagen, Sertoli- und Peritubulärzellen als wichtige Zellen der angeborenen Immunantwort des Hodens mittels Durchflusszytometrie auf Ihre Fähigkeit untersucht Galektin-1 zu binden.Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten testikulären Zelltypen Galektin-1 binden können, jedoch mit unterschiedlicher Intensität. Das Fluoreszenzsignal der Bindung von Alexa Fluor 647 konjugiertem Galektin-1 C2S an Peritubulär- und Sertoli-Zellen ist vergleichbar mit dem mononukleärer Zellen, die mittels Phytohämagglutinin stimuliert und als Positivkontrolle verwendet wurden. Im Gegensatz dazu zeigen testikuläre Makrophagen eine viel schwächere Galektin-1 Bindung, die geringer als die unstimulierter mononukleärer Zellen ausfällt. Die Spezifität der Bindung wurde durch die gleichzeitige Inkubation mit Lactose bzw. Saccharose nachgewiesen.Um den Phänotyp der auf den Zelloberflächen befindlichen Glykane zu untersuchen, welche die Affinität von Galektin-1 für die jeweiligen Zellen vermitteln, verwendeten wir Pflanzen-lektine (MAA, LEA, PNA, SNA-I) in der Analyse isolierter testikulärer Zellen mittels Durchflusszytometrie.Aus den Ergebnissen der Pflanzenlektin- und Galektin-1-Bindung konnte gefolgert werden, dass die im Vergleich zu Sertoli- und Peritubulärzellen verminderte Bindung von Galektin-1 an testikuläre Makrophagen auf einem hohen Maß an endständiger, a2-6 konjugierter Neuraminsäure an den Glykanen der Zelloberfläche beruhen könnte. Von diesem regulatorischen Mechanismus ist bekannt, dass er die unterschiedliche Empfindlichkeit von TH1- und TH2-Zellen bei induzierter Apoptose durch Galektin-1 bedingt.Zusammenfassend kann gesagt werden, dass peritubuläre und Sertoli-Zellen, aber überraschenderweise nicht testikuläre Makrophagen, die vorrangigen Zielzellen unter den untersuchten Zellen im Hoden für Galektin-1 darstellen. Damit kann Galektin-1 über eine Interaktion mit den somatischen testikulären Zellen zur immunologisch privilegierten Stellung des Hodens im Organismus beitragen.