Stadienspezifische mRNA-Expression der Kernproteine Protamin und Transitionsprotein im Verlauf der Spermatogenese beim Hengst

Abstract

Für die starke Kernkondensierung in Keimzellen im Verlauf der Spermatogenese sind nach dem Austausch der Histone, Transitionsproteine und Protamine verantwortlich.Dieses sind hoch basische spermienspezifische Kernproteine, die sich an die DNA anlagern, dabei neutralisieren und eine kompaktere Anlagerung der einzelnen DNA-Stränge ermöglichen. Es gibt verschiedene Modelle in welcher Art und Weise die Interaktion von Kernproteinen mit der DNA stattfindet.Der Austausch der Kernproteine ist spezies- und spermatogenesestadienspezifisch.Für u.a. Maus, Ratte, Mensch wurden diese Expressionsmuster auf mRNA- und Proteinebene bereits untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Klärung der stadienspezifischen Kernproteinexpression von Transitionsprotein1 und den Protaminen beim Pferd zu leisten. Zur Verfügung standen 52 orchiektomierte Hoden von 35 Hengsten unterschiedlicher Anamnese: Kastrationen von skrotal, inguinal und abdominal gelagerten Hoden.Zunächst wurden das Hodengwebe mittels HE-Färbung klassifiziert und der Spermatogensestatus bestimmt. Mittels Verfahren der In Situ- Hybridisierung wurde die mRNA der gesuchten Kernproteine nachgewiesen und ein Expressionsmuster aufgestellt. Mittels RT-PCR wurde zusätzlich der Trp1 m-RNA Nachweis geführt.Für Transitionsprotein 1 und Protamin 1 und 2 konnten stadienspezifische mRNA-Expressionsmuster festgelegt werden, die mit denen bisher untersuchter Säugetiere übereinstimmen.Für das Transitionsprotein 2 konnte kein positiver mRNA Nachweis mittels ISH oder PCR geführt werden. Die altersabhängige, d.h. bei peripubertären Hengsten verzögert einsetzende Tp1-mRNA-Expression, steht im Einklang mit den Ergebnissen von CAVALCANTI et al. (2009), die bei Hengsten dieser Altersgruppe eine verlängerte Histon H1 und H1t-Expression feststellen konnten. Wie bereits CAVALCANTI et al. (2008) annahmen, verhärtet sich mit den vorliegenden Ergebnissen der Verdacht, dass die bekannte peripubertäre, vorübergehende Sub- bzw. Infertilität mit einem unzulänglichen Histon-Protamin-Austausch begründet werden könnte.Für Spermatogenesedefekte konnte gezeigt werden, dass es unabhängig von einer vollständigen Spermatogenesewelle dann zu einer Expression kommt, wenn die normalerweise exprimierenden Zellen vorhanden sind. During spermatogenesis, histones, transitonproteins and protamines are responsible for a strong condensation of the nucleus. These are basic, spermatidspecific proteins, which bound to DNA, neutralize negative charges und faciltate a very compact storage of the DNA in the chromatin. There are different meanings about the models of interaction between DNA and the basic proteins.The exchange of transitionproteins and protamines during spermatogenesis is speciesspecific and depends on the stage of spermatogenesis.Object of this work was to establish the stagespecfic exchange of transitonproteins and protamines during equine spermatogenesis.From 35 stallions, we took altogether 52 testis. The stallions were different years old from one to sixteen and were castrated for different reasons like cryptorchism or routinely castration of scrotal testis.First, we made a HE-colouring of the testis tissues to examine the state of spermatogenesis. Using in situ-hybridization, we detected the m-RNA of transitionprotein 1, protamine 1 and 2 in stagespecific spermatids and revealed corespondig models of their m-RNA expression during the equine spermatogenesis. Using RT-PCR, additional we provided evidence of transitionprotein 1-mRNA.For transitionprotein 1, protamine 1 and 2 we revealed patterns of m-RNA expression that go together with previous examinations of other mammals like mouse, rat or man. We were not able to detect the mRNA of transitionprotein 2.In the case of transitionprotein 1, we established a different expression of mRNA relative to the age of the stallions: peripuberal stallions, younger than 2 years, showed a delayed beginning of mRNA expression in sb1 respectively sb2-spermattids of stage I and II. Stallions older than 3 years expressed already tp1-mRNA in sa-spermatids of stage VIII. This result is in accord with previous examinations from CAVALCANTI et al. (2008), who revealed an extended expression of H1 and H1t-mRNA in spermatids of peripuberal stallions.It seems to be presumable, that theres a connection between the age dependent, probably insufficient histone to transitionprotein 1 exchange and the well known temporary, peripuberal, equine sub- resp. infertility.