Untersuchungen zum Nachweis und zum Vorkommen von Ergotalkaloiden in Futtergräsern

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Ergotalkaloiden in Futtergräsern sowie dem Vorkommen dieser Toxine in Gräsern der Familie Poaceae auf deutschen Wiesen und Weiden. Insgesamt wurden 104 Grasproben aus zwei Vegetationsperioden der Jahre 2007 und 2008 untersucht. Zur Bestimmung der Toxingehalte wurden auf der Verwendung von Antikörpern gegen Ergometrin, Ergotamin, alpha-Ergocryptin und Ergocornin basierende kompetitive Enzymimmuntests angewendet. Während drei Enzymimmuntests eine Teilspezifität für einzelne Ergotalkaloide (Ergotamin, alpha-Ergocryptin und Ergocornin) besitzen, ermittelt der Generic Ergot Alkaloid -Enzymimmuntest die Summenbelastung dieser Toxine in den Probenmaterialien. Die entsprechenden Nachweisgrenzen lagen bei 0,4 ng/ml (Toxinmischung), 0,2 ng/ml (Ergotamin), 4,5 ng/ml (alpha-Ergocryptin) und 17 ng/ml (Ergocornin). In Ergänzung dazu wurden einige Ergotalkaloid-positive Proben zusätzlich mittels einer hochleistungsflüssigkeitschromatographischen Methode (HPLC) untersucht, mit der ein Nachweis von 14 Ergotalkaloiden (Ergometrin, Ergotamin, Ergocristin, alpha-Ergocryptin, beta-Ergocryptin, Ergocornin, Ergosin und deren korrespondierende -inin-Isomere) gelang. Die Grasproben konnten in den EIAs und der HPLC nach Extraktion mittels eines Acetonitril/ PBS pH 6,0-Gemisches (60/40; v/v) untersucht werden.Die Nachweisgrenzen in den Gräsern lagen bei dem gruppenspezifischen EIA für Ergotalkaloide bei 40 µg/kg bzw. bei 20 µg/kg im Ergotamin-EIA, 450 µg/kg im alpha-Ergocryptin-EIA und bei 1.700 µg/kg im Ergocornin-EIA. Bei der Ermittlung der Wiederfindungsraten in künstlich kontaminierten Probenmaterialien wurden für den gruppenspezifischen immunchemischen Nachweis für Ergotalkaloide Ergebnisse von 86 133 % erzielt.Ergotalkaloidpositive Gräser wurden in allen beprobten geografischen Regionen ermittelt. Insgesamt zeigten Gäser der Gattung L. perenne, mit Ausnahme des Testsystems für alpha-Ergocryptin, in allen weiteren Enzymimmuntests eine höhere Ergotalkaloidbelastung von Sommergräsern gegenüber Gräsern des Frühjahres. Die Ergotalkaloidbelastung bei Sommergräsern der Gattung F. arundinacea war im Generic Ergot Alkaloid -EIA höher als die Alkaloidkontamination von Gräsern des Frühjahres. Die Testsysteme des alpha-Ergocryptin-EIA und Ergocornin-EIA erwiesen sich aufgrund starker Überschätzung des Ergotalkaloid-Gehalts als nicht praxistauglich. Im gruppenspezifischen Nachweis für Ergotalkaloide betrug der Anteil positiver F. arundinacea-Proben 62 %, für Gräser der Gattung L. perenne 87 %. Die gemessenen Konzentrationen lagen zwischen 40 µg/kg und 7.500 µg/kg (FA) sowie zwischen 40 µg/kg und 28.600 µg/kg (LP). Die Medianwerte betrugen 100 µg/kg (FA) bzw. 500 µg/kg (LP). Der Anteil positiver Testergebnisse im Ergotamin-EIA betrug für F. arundinacea 96 % und für L. perenne 95 %. Der Median lag bei 65 µg/kg für F. arundinacea und bei 200 µg/kg für L. perenne. Ergotalkaloide wurden auch in anderen der Familie der Poacea angehörigen Spezies festgestellt, zumeist jedoch in niedrigeren Konzentrationen.Mit den durchgeführten Vergleichsuntersuchungen anhand natürlich kontaminierter Gräserproben wurden für Gräser der Gattung F. arundinacea und L. perenne brauchbare Übereinstimmungen zwischen den Ergebnissen der EIA-Methoden und der HPLC-Methode festgestellt (FA: r²=0,995; LP: r²=0,529 ).Die Eignung des Generic Ergot Alkaloid -Enzymimmuntests zum Nachweis von Ergotalkaloiden in Gräsern und die des enzymimmunologischen Testsystems für Ergotamin zum selektiven Nachweis dieses Alkaloids konnten mit vorliegender Arbeit bestätigt werden. This study is concerned with the application of enzyme immunoassays (EIAs) to detect ergot alkaloids in forage grasses, and also with the prevalence of these toxins in the plant family Poaceae in meadows and pastures in Germany. A total of 104 grass samples from two vegetation periods (2007 and 2008) were analysed. Competitive enzyme immunoassays based on antibodies to ergonovine, ergotamine, alpha-ergocryptine and ergocornine were applied in order to identify the level of toxins (mycotoxins). While three EIA systems have partial specificity for particular ergot alkaloids (ergotamine, alpha-ergocryptine and ergocornine), the Generic Ergot Alkaloid -EIA, as a group-specific indicator of ergot alkaloids, can be used for the simultaneous detection of toxins in the samples taken. The corresponding detection limits were 0.4 ng/ml (toxin mixture), 0.2 ng/ml (ergotamine), 4.5 ng/ml (alpha-ergocryptine) and 17 ng/ml (ergocornine).Additionally, several ergot alkaloid positive samples were analysed using High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), by which it was possible to detect fourteen ergot alkaloids (ergonovine, ergotamine, ergocristine, alpha-ergocryptine, beta-ergocryptine, ergocornine, ergosine and their corresponding -inine-isomers). After extraction in acetonitrile/PBS mixture (60/40; v/v), the grass samples were analysed by means of EIAs and HPLC. The detection limit for grass samples was 40 µg/kg using group-specific EIA for ergot alkaloids. Using ergotamine-EIA, the detection limit was 20 µg/kg, using alpha-ergocryptine-EIA it was 450 µg/kg, and using ergocornine-EIA it was 1700 µg/kg. After examining spiked grass samples, the recovery rates ranged from 86 % to 133 % when applying the group-specific immunochemical detection method for ergot alkaloids.In all geographical regions sampled, positive ergot alkaloid samples were detected. Overall, in all testing systems (with the exception of the testing system for alpha-ergocryptine), the contamination with ergot alkaloids was higher in summer grasses than in spring grasses of the species L. perenne (perennial rye-grass). In the Generic Ergot Alkaloid -EIA the contamination rate of summer grasses of the species F. arundinacea was higher than that of spring grasses. The valuation of suitability for the testing systems of the alpha-ergocryptine-EIA and the ergoconine-EIA was negative. With the group-specific detection method for ergot alkaloids, the percentage of contaminated samples of F. arundinacea was 62 % and for grasses of the species L. perenne 87 %. Sample concentration ranged from 40 µg/kg to 7500 µg/kg (FA) and from 40 µg/kg to 28600 µg/kg (LP). The median was 100 µg/kg (FA) and 500 µg/kg (LP) respectively. Forage grasses were frequently contaminated with ergotamine (FA: 96 %, LP: 95 %). The median of the concentration of ergotamine was 65 µg/kg for F. arundinacea and 200 µg/kg for L. perenne. Ergot alkaloids were also detected in other species of the Poaceae family, although only in lower concentrations.The comparative analysis of naturally contaminated grass samples indicated that the results of the Generic Ergot Alkaloid -EIA-method strongly correlated with those of the HPLC-method when applied to the genus F. arundinacea and L. perenne (FA: r²=0.995; LP: r²=0.529). The present study succeeded in confirming the suitability of the Generic Ergot Alkaloid -EIA-method for the detection of ergot alkaloids in grasses and of the enzyme immunological test system for ergotamine for the detection of this alkaloid.