Identifizierung von Phosphorylcholin-bindenden Proteinen aus Caenorhabditis elegans

Abstract

Um effiziente Pharmaka gegen Nematodeninfektionen, wie z.B. der Flussblindheit, entwickeln zu können, ist die Erforschung der Pathogenitätsmechanismen bei diesen Infektionen sehr wichtig. Diese wiederum basiert u.a. auf den Methoden der Proteinanalytik.Die vorliegende Arbeit beinhaltete zunächst die Etablierung einer Extraktionsmethode und der Durchführung der Gelektrophorese von C. elegans- Proteinen. Dabei wurde die Methodik speziell auf die Identifikation von PC-bindenen Proteinen von C. elegans ausgerichtet. Die Optimierung der Probenaufbereitung mit Lyse und Fällung zeigte sich als notwendig, um eine zufriedenstellende Qualität des resultierenden Spotmusters auf dem Gel zu erhalten. Bei der Lyse wurden drei unterschiedliche Lysispuffer (TRIS, CHAPS und ohne CHAPS) verglichen, wobei sich die Lyse mit Tris am Effektivsten gestaltete. Bezüglich der Fällung wurde die Aceton-Fällung mit der Methanol- Chloroform-Fällung verglichen. Hier zeigten sich bei der Fällung mit Methanol-Chloroform auf dem Gel weniger Salzspuren, eine höhere Quantität und Qualität der dargestellten Spots. Bei der Färbung der 2D-Gele zeigte die Silberfärbung bessere Ergebnisse als die Commassie-Färbung.Bei der isoelektrischen Fokussierung im Rahmen der zweidimensionalen Gelelektrophorese zeigte sich im Vergleich zwischen IEF-und IPG-Strips eine höhere Sensitivität bei den IPG-Strips. Die Methode der In-Gel-Rehydratisierung wurde mit dem Cup-Loading verglichen und erwies sich als vorteilhaft. Die Qualität der Säule wurde mithilfe des Akute-Phase-Proteins CRP und des Antikörpers TEPC-15 getestet. Die Affinitätschromatographie wurde bezüglich der Elutionszeit von 15 min auf 30 min erhöht, um eine ausreichende Elution des gewünschten Proteins zu erhalten. Nach Durchführung der 2-dimensionalen Gelelektrophorese waren auf dem Eluat-Gel von C. elegans im Vergleich zum Extrakt-Gel deutlich weniger Proteine erkennbar. Insgesamt wurden nach dem Verdau der Spots, der Messung durch MALDI-MS und der Datenbanksuche neun PC-bindende Proteine identifiziert. Die Analyse eines 1D-Gels derselben Probe mithilfe von ESI-MS ergab weitere 33 PC-bindende Proteine. Die Mehrzahl der Proteine scheint eine Rolle im Metabolismus, beim Lipid-Stoffwechsel und als Bestandteil der Biomembran zu spielen.