Untersuchungen zur Charakterisierung der an der Regulation des ziliären Transports beteiligten nikotinischen Acetylcholinrezeptoren im Trachealepithel der Maus

Abstract

ACh ist ein klassischer Neurotransmitter, der ebenfalls von vielen non-neuronalen Geweben, so auch Trachealepithelzellen, synthetisiert wird und seine Wirkung über MR und nAChR vermittelt. In non-neuronalen Zellen des Trachealepithels ist die Beteiligung der M3R an der Regulation des Zilienschlags bereits bekannt, und in einer vorangegangenen Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass durch Stimulation nAChR mittels Nikotin die PTG im Trachealepithel der Maus Zilien-vermittelt gesteigert wird. Die von unserer Arbeitsgruppe etablierte Methode zur Messung der PTG ermöglicht es, die ziliäre Komponente des Partikeltransports unabhängig vom Einfluss der unter normalen physiologischen Bedingungen die Zilien bedeckenden Mukusschicht zu beurteilen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass nicht die Funktion einzelner Zilien, sondern der gerichtete Partikeltransport über einem relativ großen Abschnitt der Trachea gemessen wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, welche nAChR-Untereinheiten an der Regulation der Zilien-vermittelten PTG beteiligt sind.Die nAChR sind in der Zellmembran lokalisierte Liganden-gesteuerte Ionenkanäle, von denen bis heute insgesamt 17 verschiedene Untereinheiten bekannt sind. Daraus ergibt sich eine Vielzahl möglicher zusammengesetzter Rezeptorsubtypen. Die unterschiedliche Zusammensetzung und Stöchiometrie der Rezeptoren beeinflussen dabei nicht nur die Ionenselektivität, sondern resultieren auch in unterschiedlichen Affinitäten für Liganden. Aufgrund dieser Ligandenaffinität konnten zur Abklärung der Beteiligung einzelner Rezeptorsubtypen an der PTG spezifische Antagonisten verschiedener Untereinheiten eingesetzt werden.Im Anschluss an PTG-Versuche mit erfolgreicher Nikotin-Stimulation wurde das Trachealepithel abgeschabt und in RT-PCR-Untersuchungen die Expression der nAChR-Untereinheiten untersucht. Aufgrund des ermittelten Expressionsprofil wurden in anschließenden PTG-Versuchen die Antagonisten DhbE (gegen die a4b2-, a3b2-, a3b4-Untereinheiten), a-BTX (gegen die a7- und a9-Untereinheiten) sowie Strychnin (gegen die a9a10-Untereinheit) eingesetzt und deren konzentrationsabhängige Wirkung ermittelt. Darüber hinaus wurden PTG-Versuche an a3-BAC-transgenen eGFP-Mäusen, die neben der Expression von eGFP unter dem Promoter der a3-Untereinheit des nAChR eine Überexpression der b4-Untereinheit aufweisen, durchgeführt, um den möglichen Einfluss der b4-Untereinheit auf die PTG zu untersuchen. In allen durchgeführten Versuchen wurde durch abschließende Zugabe von ATP die Vitalität der Trachea überprüft.Weder die Inhibition der a4b2-, a3b2-, a3b4-Untereinheiten durch DhbE und der a7- und a9-Untereinheiten durch a-BTX, noch die Überexpression der b4-Untereinheit hatten Einfluss auf den durch Nikotin induzierten Anstieg der PTG. Ausschließlich Strychnin, ein Antagonist der a9a10-Untereinheit, war in der Lage, die durch Nikotin induzierte Steigerung der PTG vollständig zu hemmen. In dem ermittelten Expressionsprofil wurden in allen untersuchten Trachealepithelproben die Untereinheiten a10 und b2 detektiert, während die a9-Untereinheit in lediglich 20 % der Proben nachgewiesen wurde. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu Publikationen, in denen die a10-Untereinheit bisher ausschließlich als funktionelle Einheit zusammen mit der a9-Untereinheit beschrieben wurde. An diesem a9a10-Rezeptor wurde darüber hinaus Nikotin als Antagonist bzw. als wirkungslos beschrieben, während es in den von uns durchgeführten Versuchen einen Anstieg der PTG bewirkte. Diese Ergebnisse lassen auf die Existenz eines neuen, bisher nicht beschriebenen Rezeptors, der die a10-Untereinheit beinhaltet, schließen, der maßgeblich an der Regulation der durch Nikotin induzierten Steigerung der PTG beteiligt ist. Acetylcholine (ACh) is a classical neurotransmitter that is also synthesized by many non-neuronal cells, such as airway epithelium, and acts via muscarinic (MR) and nicotinic acetylcholine receptors (nAChR). In non-neuronal cells of the airway epithelium it is known that muscarinic receptor M3 (M3R) is involved in regulating ciliary beating. In a previous thesis it was shown that nicotine increases cilia-driven particle-transport speed (PTS) in the tracheal epithelium of the mouse via activation of nAChR. The method of measuring PTS, which was established by our group, makes it possible to evaluate the ciliary component of PTS regardless of mucus, which covers the cilia under physiological conditions. The advantage of this method is that not singular cilia function, but directed particle transport on a long section of the trachea can be investigated. The role of different nAChR subunits in increasing PTS has been less defined yet. The aim of this work was to determine which nAChR subunits are involved in the regulation of cilia-driven PTS.Nicotinic AChR are ligand-gated ion channels that are localized in the cell membrane. Seventeen different subunits are currently known. This results in a high number of potential receptor subtype compositions. Receptor composition and stoichiometry determine ion-selectivity as well as affinity for different ligands. Based on these ligand-affinities nAChR subunit specific antagonists were utilized to clarify which nAChR subunits are involved in regulating PTS.After PTS experiments with nicotine stimulation, the tracheal epithelium was abraded and the nAChR subunit expression was analyzed via RT-PCR. Based on the detected expression profile, the antagonists DhbE (against a4b2-, a3b2-, a3b4-subunits), a-BTX (against a7- and a9-subunits) and strychnine (against a9a10-subunit) were applied in PTS experiments and their concentration dependant effect was determined. Furthermore, PTS experiments with a3-BAC-transgenic eGFP-mice, that in addition to the expression of eGFP under the promoter of nAChR subunit a3 exhibit overexpression of b4-subunit, were performed to investigate a possible impact of b4-subunit on PTS. At the end of each experiment the vitality of the trachea was tested by addition of ATP. Neither inhibition of a4b2-, a3b2-, a3b4-subunits via DhbE and a7- and a9-subunits via a-BTX, nor overexpression of b4-subunit did affect the nicotine induced increase of PTS. Only strychnine, an antagonist to nAChR subunits a9 and a10, was able to inhibit the nicotine-induced increase of PTS. RT-PCR exhibited presence of a10- and b2-subunit mRNA in all investigated samples of tracheal epithelium, while the a9-subunit was detected in only 20 % of the samples. This finding is in contrast to the prevailing view that the a10-subunit serves as a functional unit only in association with the a9-subunit. Also, nicotine was described as an antagonist or as being ineffective on this a9a10-receptor while in our experiments it was a powerful stimulus of PTS. These results suggest the existence of a new, so far unknown, receptor including nAChR-subunit a10 which appears to be involved in nicotine induced cilia-driven particle transport in the trachea.