Regulation und Funktion der NADPH-Oxidase 1 in pulmonalvaskulären glatten Muskelzellen aus Ratten im Modell der Monocrotalin-induzierten pulmonalen Hypertonie

Abstract

Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine schwerwiegende Erkrankung der pulmonalarteriellen Gefäße und ist durch einen hohen mittleren pulmonalarteriellen Blutdruck charakterisiert. Die Krankheit steht in Verbindung mit einem Umbau der betroffenen Gefäße, dem sog. Remodeling. Dadurch wird das Lumen der Gefäße verringert, es kann zu einem Verlust von Gefäßen kommen und der Blutdruck steigt an. Obwohl kontrovers diskutiert, geht eine Hypothese davon aus, dass der Umbauprozess, unter anderem, durch die vermehrte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ausgelöst werden kann, wodurch es in den Zellen der Gefäßwand zu oxidativem Stress kommt, der eine Dedifferenzierung, sowie eine unkontrollierte Migration und Proliferation von verschiedenen Zelltypen der Gefäßwand verursacht. Es ist bekannt, dass bei verschiedenen Formen der pulmonalen Hypertonie die pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMC) wesentlich an dem genannten Gefäßumbau beteiligt sind, so dass es zu einer verstärkten Muskularisierung von bereits muskularisierten Gefäßen und einer de novo-Muskularisierung von nicht-muskularisierten Gefäßen kommt. Neben den Mitochondrien sind nicht-phagozytäre NADPH-Oxidasen eine mögliche Quelle der ROS-Produktion. Für die tierexperimentelle Erforschung von PH sind insbesondere zwei experimentelle Modelle etabliert: 1. Hypoxie-induzierte PH und 2. Monocrotalin (MCT)-induzierte PH.Jüngst konnte gezeigt werden, dass die ROS-Produktion der PASMC im Modell der Hypoxie-induzierten PH erhöht ist und dies zum Großteil auf die verstärkte Expression bzw. Aktivität von nicht-phagozytären NADPH-Oxidasen zurückzuführen ist. Im Modell der MCT-induzierten PH ist nicht bekannt, ob es zu einer vermehrten ROS-Produktion kommt und auch über die etwaige Quelle einer solchen ROS-Produktion gibt es in diesem Modell keine Erkenntnisse. Aufgrund dessen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob sich 1. auch im MCT-Modell der PH eine verstärkte ROS-Produktion durch PASMC beobachten lässt und 2. ob es zur Veränderung des antioxidativen Potentials der PASMC kommt. Darüber hinaus sollten 3. Ansatzpunkte erarbeitet werden, um die möglichen Quellen einer etwaigen ROS-Bildung und deren Effekt auf zelluläre Funktionen im MCT-Modell aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Einfluss von MCT auf die ROS-Produktion der PASMC von Rattus norvegicus untersucht. Außerdem galt das Interesse der Expression und Aktivität antioxidativer Enzyme, der Migration, Proliferation und Apoptose der PASMC, sowie den durch ROS beeinflussten Signalwegen. Untersucht wurden PASMC aus Tieren, bei welchen durch Monocrotalin eine PH induziert wurde und PASMC aus gesunden Kontroll-Tieren. Mit Hilfe von ESR-Spektroskopie und DHE-Färbung konnte eine Zunahme der intrazellulären Superoxidproduktion in MCT-PASMC gezeigt werden. Durch real-time PCR und western blot Analysen konnte einer erhöhte Expression von Nox1 nachgewiesen und mittels siRNA-Experimenten als Quelle der beschrieben Superoxidproduktion identifiziert werden. In folgenden Experimenten wurde Nox1 als Ursache für eine beschleunigte Proliferation und Migration von MCT-PASMC identifiziert. Die Proliferation unterlag einer Nox1-abhängigen Zunahme der Cyclin D1-Expression. Der Migration konnte kein Nox1-abhängiger Signalweg zugeordnet werden. Weiter konnte, basierend auf einer erhöhten Expression von Nrf2 und Sod2 zusammen mit der erhöhten Superoxid-Produktion, auf oxidativen Stress in MCT-PASMC geschlossen werden. Die Supprimierung von Nox1 führte zur Normalisierung der Nrf2-Expression, Sod2 zeigte eine deutliche Tendenz in Richtung einer verminderten Expression, jedoch nicht signifikant. Als potentieller Auslöser der gesteigerten Nox1-Expression in PASMC nach MCT-Behandlung wurde PDGF identifiziert, da PDGF-Stimulation zu einer Zunahme der Nox1-Expression in PASMC führte. Diese Befunde weichen von den Erkenntnissen im Modell der Hypoxie-induzierten PH deutlich ab, insofern anstelle von Nox4, Nox1 verantwortlich ist. Zumindest mit Bezug auf die hier untersuchten humanen Proben, konnten die Ergebnisse nicht auf die humane IPAH übertragen werden. Allerdings handelt es sich beim MCT-Modell, zumindest initial, um eine stark inflammatorisches Modell. Möglicherweise stellen die Ergebnisse somit ein grundlegendes Charakteristikum der Ausbildung von pulmonalen Hypertonien dar, welche mit inflammatorischen Erkrankungen assoziiert sind, bzw. generell von inflammatorischen Gefäßerkrankungen.Sollte sich die Übertragbarkeit dieses Postulats auf die humanen Erkrankungen bestätigen, wäre die vermehrte Produktion von Superoxidradikalen durch Nox1 in den PASMC ein möglicher Ansatzpunkt für eine Behandlung dieser Erkrankungen. Pulmonary hypertension (PH) is a severe disease of the pulmonary arterial vasculature and is characterized by an increase of the mean pulmonary arterial pressure. PH is accompanied with a remodeling of the affected vessels. The lumen of the vessels is decreased, and the blood pressure is increased. Although controversially discussed, one hypothesis suggests that the remodeling could, among other factors, be due to an increased production of reactive oxygen species (ROS), which is associated with oxidative stress inside the cells. Oxidative stress causes dedifferentiation, but also unregulated migration, and proliferation of various cell types in the vascular wall. It is a common feature of most PH forms that pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC) are intrinsically involved in the vascular remodeling process. The uncontrolled migration and proliferation of PASMC causes enhanced muscularization of muscularized vessels and a de novo-muscularization of non-muscularized vessels. Besides mitochondria, non-phagocytic NADPH-oxidases are a possible source of ROS production. For investigation of PH in animals, two experimental models are mainly used: 1. hypoxia-induced PH, and 2. MCT-induced PH. Recently it was shown that PASMC-derived ROS production is increased under hypoxia, and that non-phagocytic NADPH-oxidases are highly expressed under such conditions. Currently no data about the regulation of ROS and their potential source in MCT-induced PH are available. The objectives of the present study were thus to investigate, 1. if there is, similar to hypoxia-induced PH, an increased ROS production of PASMC in the MCT-induced PH and 2. if there is a change in the oxidative potential of the PASMC. Additionally, the study aimed to discover a potential source of ROS production, and their effect on cellular functions in the MCT-model. Therefore, the effect of MCT on the ROS production of PASMC isolated from Rattus norvegicus was analyzed. Also, the expression of antioxidative enzymes, migration, proliferation and apoptosis, as well as ROS sensitive pathways were examined. PASMC isolated from rats with MCT-induced PH have been used, as well as PASMC of untreated controls.ESR recordings and DHE-staining could demonstrate an increase of the intracellular superoxide production in MCT-PASMC. Real-time PCR and western blot analysis revealed an increased expression of Nox1, which was identified as the source of intracellular superoxide production by RNAi experiments. In subsequent experiments, Nox1 was proven to be the reason for elevated migration and proliferation of MCT-PASMC. Changes in proliferation were caused by a Nox1-dependent upregulation of Cyclin D1. For migration no Nox1-dependent pathway has been found. Further, MCT-PASMC show oxidative stress, as supported by increased superoxide levels as well as by upregulation of Nrf2 and Sod2. Knockdown of Nox1 normalized Nrf2 expression and Sod2 expression by trend. As the possible trigger for increased Nox1 expression after MCT-treatment PDGF was identified, since PDGF stimulation led to an upregulation of Nox1 in PASMC. Compared to previous observations made in hypoxia-induced PH, it could be proven that Nox1, and not Nox4, is responsible for this effect in MCT-induced PH. When referring to the available analyzed human samples, these results could not be translated into human IPAH. However, the MCT model is an inflammatory model for PH. It is well possible that these data reflect basic characteristics of the development of PH associated to inflammatory diseases or inflammatory disease of the vasculature in general. If the transferability of this postulate should be confirmed, the increased superoxide production by Nox1 in PASMC might represent a new field for development of PH therapies.