Evaluierung verschiedener Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma

Abstract

Die künstliche Besamung gewinnt in der Hundezucht immer mehr an Bedeutung.Dabei können durch die Verwendung von flüssigkonserviertem Sperma selbst beivaginaler Deponierung des Samens i. d. R. deutlich bessere Trächtigkeitsratenund höhere Wurfgrößen erzielt werden als mit kryokonserviertem Sperma, einoptimales Besamungsmanagement vorausgesetzt. Zudem ist die Flüssigkonservierung von Sperma hinsichtlich Herstellung und Versand einfacher und kostengünstiger als die Kryokonservierung. Limitierend beim Einsatz von flüssigkonserviertem Sperma ist jedoch die begrenzte Überlebensdauer der Samenzellen.In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample-Verfahren drei verschiedene Verdünner für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°Cvergleichend untersucht. Dabei handelte es sich um den kommerziellen VerdünnerCaniPRO Chill 10 (CP) und zwei nichtkommerzielle Verdünner (TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner (TE) und Uppsala Equex-2 System). Beim zweiphasigenUppsala Equex-2 System waren zwei Versuchsteile zu unterscheiden: InVersuchsteil I erfolgte die Verdünnung mit Verdünner 1 und Verdünner 2 desUppsala Equex-2 Systems (Up 1 + 2), in Versuchsteil II nur mit Verdünner 1 (Up 1).Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, den am besten geeignetenVerdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma bei 4°C über einenLagerungszeitraum von zehn Tagen zu bestimmen. Zudem sollte geprüft werden,wie lange eine akzeptable Spermaqualität in den verdünnten Ejakulatenaufrechterhalten werden kann. Dazu wurde von 30 Rüden jeweils ein Ejakulatfraktioniert gewonnen und die spermienreiche Fraktion mittels klassischer undmoderner spermatologischer Untersuchungsmethoden (CASA-System SpermVision ) hinsichtlich Motilität (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit(VW), CASA-Gesamtmotilität (GMCASA), CASA-Vorwärtsbeweglichkeit (VWCASA)),Viabilität (Lebend-Tot-Anteil im Eosinausstrich (Lebende), CASA-Viabilität nachSYBR-14/PI-Färbung (ViaCASA)), Pathomorphologie (Eosinausstrich; Patho),akrosomaler Veränderungen (Spermac®-Färbung; AV) und funktioneller Integritätder Plasmamembran (Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS-Test;HOS) beurteilt. Im Anschluss wurden die Ejakulate in drei Aliquote geteilt und es erfolgte die Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern. Unmittelbar nach der Herstellung (Tag 0) wurden in den verdünnten Ejakulaten die gleichenBeurteilungsparameter untersucht wie in den Nativejakulaten. Nach 1, 2, 3, 5, 7und 10 Tagen Lagerung bei 4°C wurden 100 Pl-Aliquote der verdünnten Ejakulatefür fünf Minuten im Wasserbad auf 37°C angewärmt und anschließend hinsichtlichVW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA, Patho und AV beurteilt.Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischenden verschiedenen Rüden. Die durchschnittlich ermittelten Werte waren: VW80,8 ± 9,5 %, GMCASA 70,9 ± 18,1 %, VWCASA 65,0 ± 19,9 %, Lebende 87,4 % (80,6-92,9 %), ViaCASA 82,7 % (71,0-91,9 %), Patho 10,3 % (SF = 1,66), AV 2,7 %(SF = 2,63) und HOS 3,1 % (SF = 2,34). Durch die Verdünnung mit denverschiedenen Verdünnern wurden die untersuchten Parameter mit Ausnahmevon HOS (CP: 5,0 % (SF = 2,23); TE: 4,7 % (SF = 2,12); Up 1 + 2: 8,0 %(SF = 2,16); Up 1: 4,3 % (SF = 1,69) nicht wesentlich beeinflusst (Tag 0).Insgesamt nahm die Spermaqualität über den Untersuchungszeitraum von zehnTagen jedoch in allen verdünnten Ejakulaten kontinuierlich ab. DieFlüssigkonservierung bewirkte in allen verdünnten Ejakulaten eine signifikanteReduktion der Motilität (VW, GMCASA, VWCASA), eine signifikante Verlangsamungder Spermiengeschwindigkeit und eine signifikante Verminderung der Viabilität(Lebende, ViaCASA), wohingegen es in fast allen verdünnten Ejakulaten zu einergeringgradigen, aber signifikanten Zunahme der Pathomorphologie und zu einemsignifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungenkam. Ausgehend von einer initialen VW von 77,8 ± 11,4 % (CP) / 77,2 ± 14,3 %(TE) / 73,8 ± 18,0 % (Up 1 + 2) / 75,8 ± 13,8 % (Up 1) unmittelbar nach derHerstellung (Tag 0) war nach zehn Tagen noch eine VW von 58,2 ± 22,1 % (CP) /49,3 ± 23,9 % (TE) / 3,5 ± 4,6 % (Up 1 + 2) / 16,2 ± 12,1 % (Up 1), nachweisbar. Die ViaCASA an Tag 0 betrug 84,3 % (71,4-93,8 %) (CP) / 83,6 % (69,6-93,9 %) (TE) / 75,2 % (57,0-89,6 %) (Up 1 + 2) / 85,1 % (76,5-92,0 %) (Up 1) und verminderte sich über den Untersuchungszeitraum auf 58,8 % (41,7-74,9 %) (CP) / 59,7 % (40,8- 77,3 %) (TE) / 37,7 % (22,2-54,6 %) (Up 1 + 2) / 68,0 % (57,6-77,5 %) (Up 1) an Tag 10. Demgegenüber nahm die Patho zwischen Tag 0 (CP: 7,4 % (SF = 2,21); TE: 8,2 % (SF = 1,93); Up 1 + 2: 7,9 % (SF = 2,08); Up 1: 9,3 % (SF = 1,72)) und Tag 10 (CP: 10,7 % (SF = 2,04); TE: 10,7 % (SF = 2,19); Up 1 + 2: 9,8 % (SF = 2,26); Up 1: 10,6 % (SF = 1,96)) zu und auch für die AV konnte mit Ausnahme der mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate ein Anstieg zwischen Tag 0 (CP: 4,2 % (SF = 2,43); TE: 3,9 % (SF = 2,67); Up 1 + 2: 6,6 % (SF = 2,18); Up 1: 2,8 % (SF = 2,34)) und Tag 10 (CP: 7,6 % (SF = 2,57); TE: 8,5 % (SF = 2,14); Up 1 + 2: 4,0 % (SF = 2,72); Up 1: 8,2 % (SF = 1,78)) beobachtet werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten für eine Lagerungsdauer von zehn Tagen eine akzeptable Spermaqualität aufrechterhalten werden konnte. Die Motilität (VW, GMCASA, VWCASA) sowie die Spermiengeschwindigkeit waren über den Untersuchungszeitraum im Verdünner CP signifikant höher als in den anderen getesteten Verdünnern. Bezüglich der Viabilität (Lebende, ViaCASA) erwies sich im Zeitverlauf der Verdünner Up 1 als signifikant überlegen. Bei Betrachtung der Pathomorphologie war der Verdünner Up 1 + 2 signifikant besser als der Verdünner CP und Letzterer wiederum signifikant besser als der Verdünner TE. Hinsichtlich der akrosomalen Veränderungen konnten mit dem Verdünner Up 1 signifikant bessere Ergebnisse erzielt werden als mit dem Verdünner CP. Insgesamt betrachtet wurde die Spermaqualität und insbesondere die Motilität jedoch im Verdünner CP am besten konserviert, auch wenn die Unterschiede zu den anderen getesteten Verdünnern nicht für alle Parameter signifikant waren. Aufgrund dessen scheint der Verdünner CP den anderen getesteten Verdünnern überlegen und wird daher für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C empfohlen.Da in der vorliegenden Arbeit allerdings ungeklärt bleibt, inwieweit sich dieFertilität des flüssigkonservierten Spermas im Zeitverlauf verändert und welcheAuswirkungen die getesteten Verdünner auf den Erhalt der Befruchtungsfähigkeitder Samenzellen haben, sind weitere Studien notwendig, um den Erhalt derBefruchtungsfähigkeit während der Langzeit-Flüssigkonservierung in vivo und invitro näher zu charakterisieren. The importance of artificial insemination in dog breeding has significantlyincreased during the last decade. Using chilled semen, higher pregnancy ratesand litter sizes can be achieved compared to the use of cryopreserved semen,even after vaginal deposition, provided that there is an optimal inseminationmanagement. Furthermore, with regard to production and shipping, chilling ofsemen is easier to perform and cheaper than cryopreservation. However, thelimited life span of sperm cells after chilling is limiting the use of extended semen.In the present study, three different extenders were compared using split-sampletechnique for chilling of canine semen and storage at 4°C. It concerned thecommercial extender CaniPRO Chill 10 (CP) and two non-commercial extenders(TRIS-fructose-egg yolk extender (TE) and Uppsala Equex-2 system). With thetwo-phase Uppsala Equex-2 system, two test parts have to be distinguished: Inpart I of the experiment, both extenders (Up 1 + 2) were used for dilution; whereas in part II of the experiment only extender 1 was used (Up 1). The aim of this study was to determine the most suitable extender for chilling of dog semen over a storage period of ten days at 4°C. In addition, it should be tested how long an acceptable semen quality can be maintained in the diluted samples. Therefore, from each of 30 males one fractionated ejaculate was collected and the sperm rich fraction was examined by means of classical and modern spermatological investigation methods (CASA-system SpermVision ) for motility (subjectively estimated progressive motility (VW), total motility determined by CASA (GMCASA), progressive motility determined by CASA (VWCASA)), viability (live-dead ratio in eosin-stained smears (Lebende), viability determined by CASA after staining with SYBR-14/PI (ViaCASA)), pathomorphology (eosin-stained smears; Patho), acrosomal changes (staining with Spermac®; AV) and functional integrity of the plasma membrane (percentage of sperm cells with membrane defects in the HOS test; HOS). Subsequently, the sperm rich fractions were divided into three equal aliquots and processed with the different extenders. Immediately after dilution (day 0) the same parameters were examined in the diluted ejaculates as in the native semen samples. After 1, 2, 3, 5, 7 and 10 days of storage at 4°C, aliquots of 100 Pl of the diluted ejaculates were pre-warmed at 37°C in the water bath for five minutes and subsequently examined for VW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA, Patho and AV.In the fresh ejaculates, the investigated parameters varied between differentmales. The average values were: VW 80.8 ± 9.5 %, GMCASA 70.9 ± 18.1 %, VWCASA65.0 ± 19.9 %, Lebende 87.4 % (80.6-92.9 %), ViaCASA 82.7 % (71.0-91.9 %), Patho10.3 % (DF = 1.66), AV 2.7 % (DF = 2.63) and HOS 3.1 % (DF = 2.34). With theexception of HOS (CP: 5.0 % (DF = 2.23); TE: 4.7 % (DF = 2.12); Up 1 + 2: 8.0 %(DF = 2.16); Up 1: 4.3 % (DF = 1.69)), the investigated parameters were notsubstantially influenced by the dilution with the different extenders (day 0).However, overall semen quality of the diluted semen samples decreasedcontinuously during the observation period of ten days. Chilling of ejaculatescaused a significant reduction of motility (VW, GMCASA, VWCASA), a significantslowing down of sperm velocity and a significant decrease in viability (Lebende,ViaCASA), whereas in almost all diluted ejaculates there was a slight, but significant increase in pathomorphology and a significant augmentation in the proportion of sperm cells with acrosomal changes. Starting from an initial VW of 77.8 ± 11.4 % (CP) / 77.2 ± 14.3 % (TE) / 73.8 ± 18.0 % (Up 1 + 2) / 75.8 ± 13.8 % (Up 1) immediately after dilution (day 0), after ten days there was still a VW of 58.2 ± 22.1 % (CP) / 49.3 ± 23.9 % (TE) / 3.5 ± 4.6 % (Up 1 + 2) / 16.2 ± 12.1 % (Up 1). ViaCASA on day 0 was 84.3 % (71.4-93.8 %) (CP) / 83.6 % (69.6-93.9 %) (TE) / 75.2 % (57.0-89.6 %) (Up 1 + 2) / 85.1 % (76.5-92.0 %) (Up 1) and decreased during the observation period to 58.8 % (41.7-74.9 %) (CP) / 59.7 % (40.8-77.3 %) (TE) / 37.7 % (22.2-54.6 %) (Up 1 + 2) / 68.0 % (57.6-77.5 %) (Up 1) on day 10. In contrast, Patho increased from day 0 (CP: 7.4 % (DF = 2.21); TE: 8.2 % (DF = 1.93); Up 1 + 2: 7.9 % (DF = 2.08); Up 1: 9.3 % (DF = 1.72)) to day 10 (CP: 10.7 % (DF = 2.04); TE: 10.7 % (DF = 2.19); Up 1 + 2: 9.8 % (DF = 2.26); Up 1: 10.6 % (DF = 1.96)) and also for AV, there was with the exception of the ejaculates diluted with Up 1 + 2 an increase from day 0 (CP: 4.2 % (DF = 2.43); TE: 3.9 % (DF = 2.67); Up 1 + 2: 6.6 % (DF = 2.18); Up 1: 2.8 % (DF = 2.34)) to day 10 (CP: 7.6 % (DF = 2.57); TE: 8.5 % (DF = 2.14); Up 1 + 2: 4.0 % (DF = 2.72); Up 1: 8.2 % (DF = 1.78)). These results show that in the ejaculates diluted with CP and TE, an acceptable semen quality could be maintained for a storage period of ten days.During the observation period, motility (VW, GMCASA, VWCASA) and sperm velocitywere significantly higher in samples extended with CP than in samples extendedwith the other extenders tested. Regarding viability (Lebende, ViaCASA) over time,the Up 1 extender proved to be significantly superior to the other extenders.Concerning pathomorphology, the Up 1 + 2 extender was significantly better thanthe CP extender and the latter in turn significantly better than the TE extender.With regard to the acrosomal changes, significantly better results could beobtained with the Up 1 extender than with the CP extender. However, overallsemen quality and in particular motility was best preserved in the CP extender,even if the differences to the other extenders tested were not significant for all the parameters. Due to these results, the extender CP seems to be superior to the other extenders tested and is therefore recommended for chilling of canine semen at 4°C.However, as in the present study it remained unclear to what extent the fertility of the chilled, extended semen changes over time and what effects the extenders tested have on preservation of the fertilizing capacity of the sperm cells, further studies are necessary to characterize the preservation of the fertilizing capacity in vivo and in vitro.