Hypoxia Inducible Factor (HIF)-1 blockade attenuates early graft dysfunction in a model of rat orthotopic lung transplantation

Abstract

Für alle Organe ist Hypoxie ein gefährlicher Zustand, der sich allerdings gerade während chirurgischen Eingriffen oft nicht vermeiden lässt. Die bei Eingriffen oft durch Unterbrechung der Blutversorgung auftretende Ischämie führt durch den versiegenden Zustrom von frischem, sauerstoffreichem Blut zur Hypoxie. Besonders Transplantate sind aufgrund der Entfernung aus dem Spender und der oft längeren Lagerung bis zur Vorbereitung des Empfängers, von einer extremen Ischämie betroffen. Diese unvermeidliche Ischämie ist auch der Grund für die Schäden durch Hypoxie und Ischämie die sich bei der Reperfusion des Organs im Spender präsentieren. Diese Ischämie- und Reperfusionsschäden führen häufig zu Folgeschäden wie der Primären Transplantat Dysfunktion (Primary Graft Dysfunction PGD) die einen Funktionsverlust zur Folge hat ( z.B. die Bronchiolitis obliterans in der Lunge) und auch im kompletten Transplantatverlust gipfeln kann. Dieser Funktionsverlust ist besonders dramatisch wenn das transplantierte Organ eine Versorgerfunktion für den gesamten Organismus innehat, wie es bei der Lunge der Fall ist. Daher ist die genaue Reaktion des Transplantats auf die nicht zu vermeidende Ischämie und die Rolle der auf Hypoxie reagierenden Gene von besonderem Interesse um Folgeschäden zu vermindern und den Transplantationsprozess stetig zu verbessern. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit der Rolle des Hypoxia Inducible Faktors-1 (HIF-1) und seines Genprodukts, dem Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in der Lungentransplantation. Es wurde bereits beschrieben dass die Raufregulation von VEGF mit der Ödembildung und anderen pathologischen Veränderungen in der Lunge zusammenhängt. Unter Anbetracht dieser Tatsache scheint eine Inhibition von HIF-1 als Hauptregulator von VEGF ein interessanter Ansatz bei der Verminderung von Transplantatschäden in der Lunge zu sein. Als Inhibitor wurde ein bereits in der Krebsforschung als HIF-1 Inhibitor beschriebendes Rotenoid namens Deguelin verwendet, das in den Studien vor allem eine Gefäßwachstum hemmende Wirkung in Bezug auf HIF-1 zeigte. Um die Auswirkung einer Hemmung unter möglichst kliniknahen Bedingungen zu untersuchen wurde von unserer Arbeitsgruppe ein Transplantationsmodell an der Ratte etabliert und modifiziert, bei dem der linke Lungenflügel orthotop transplantiert wurde. Dieses Modell hat den Vorteil einer sehr realen Transplantationsbeobachtungen, bei der das Transplantat komplett an den Kreislauf des Empfängers angeschlossen und somit funktionstüchtig ist, anders als bei vielen anderen Modellen, bei denen nur sehr geringer Kontakt zum Empfänger besteht und oft keine Ventilation und komplette Perfusion der transplantierten Lunge gegeben ist. Die Transplantationsmethode wurde nach einer früher beschriebenen Cuff-Methode modifiziert, um einige auftretende Komplikationen zu verbessern. Die Veränderungen zeigten eine deutliche Verbesserung in Bezug auf chirurgische Komplikationen und somit weniger Tiere, die aufgrund dieser vom Versuch ausgeschlossen werden mussten. Die dafür benötigte Zeit für die Transplantation, die aufgrund der eintretenden warmen Ischämie, entscheidend ist, unterschied sich nicht von der Methode die unserer zugrunde lag. Die Schmerztherapie die wir verwendeten vermied eine präoperative Opioidinjektion um die darauf folgende Atemdepression zu vermeiden die besonders in den ersten Stunden nach Transplantation gefährlich war. Wir konnten zeigen das ein Interkostaler Nervenblick mit einem Lokalanästhetikum zu einer Verbesserung des Animal-Health Scores führte verglichen mit einer präoperativen Opoidinjektion. Bezüglich der Effekte von Deguelin auf die untersuchten Tiere konnten wir zeigen, das eine in vitro Deguelingabe zu einer signifikanten konzentrationsabhängigen Inhibition von HIF-1 Reportergenen wie VEGF, Carboanhydrase IX (CAIX), Lysyloxidase (LOX), Angiopoietin related protein 4 (ANGPTL4), Egl nine homolog 3 (EGLN3) und Adrenomedullin (ADM) führt. Außerdem konnten wir eine mit der Deguelingabe zusammenhängende Runterregulation von mRNA von VEGF, Chemokine Receptor Type 4 (CXCR4) und Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) in der ischämischen Lunge feststellen. Desweiteren zeigte sich eine deutliche Verminderung des VEGF modulierten Reperfusionsödems bei den mit Deguelin behandelten Tieren. Unter Deguelingabe zeigte sich auch eine Runterregulation von proinflammatorischen Proteinen wie ICAM-1 und CXCR4 feststellen, während antiinflammatorische Monozyten (CD 163, CD 68) scheinbar unter Deguelingabe in das transplantierte Organ rekrutiert wurden. Diese Erkenntnisse in Verbindung mit der deutliche besseren Überlebensrate der mit Deguelin behandelten Tiere, lassen den Schluss zu, das eine Inhibition von HIF-1 eine Verbesserung für das Lungentransplantat darstellt und Schäden vermindern kann. Hypoxia is a dangerous condition for every organ and often cannot be completely avoided during surgical intervention. This is a result of ischemia which occurs when blood flow and, therefore, supply with the needed oxygen has to be interrupted for some time. During a transplantation process, the ischemia is very severe as the organ has to completely removed from all supplying blood vessels and stored for hours in this case until the recipient is made ready. Due to this, ischemic damage and hypoxic condition is one of the important factors that influence the graft and can lead to primary graft dysfunction (PGD) which might end in the loss of function (bronchiolitis obliterans) or even the complete rejection of the organ. The loss of function is even more dramatic if the transplanted organ has to supply the complete organism with oxygen as the lung. Therefore, the reaction of a lung graft to the non-avoidable ischemic conditions and the role of hypoxia responding genes is crucial to refine the transplantation process.In this work we concentrate on the role of the hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) and its gene product the vascular endothelial growth factor (VEGF) in the lung transplantation. It was already described earlier, that upregulation of VEGF showed a responsibility for the development of edema in the lung and other pathological changes. Under this aspect an inhibition of HIF-1 as the main regulator of VEGF seems an interesting approach for the reduction of graft damage. Therefore the known rotenoid Deguelin, which was already described in its inhibitory effects on HIF-1 concerning its vascular growth abilities in cancer research, was used. To investigate the effects under the most concrete clinical situation, our group established and refined an orthotope left lung lobe transplantation in the rat which was modified after an already known cuff-technique method of lung transplantation. This method bears the benefit that the lung is completely connected to all structures of the recipient and functions as a real lung lobe transplant over the observation time, different from other methods where only the contact to the foreign organism is guaranteed but not the ventilation or complete perfusion. Our modification on the microsurgial procedure in the rat bears furthermore some advantages especially for scientists that are new on the field of microsurgery. We could demonstrate that these modifications bear fewer risks of complications and, thus, fewer cases of early terminated animals during the experiment. Also the needed time for the transplantation process, which is essential to keep warm ischemia as short as possible was equal compared to the other method. The pain management we used in our method avoided a presurgical injection of an opioid which always made a respiratory depression that was dangerous for the recovery during the first hours after transplantation. We could demonstrate that our intercostals block with a local anesthetic resulted in much better animal health compared to a classical presurgical opioid-injection. Concerning the effects of Deguelin, we could show that Deguelin significantly inhibited HIF-1 reporter genes as VEGF, Carbonic anhydrase IX (CAIX), lysyl oxidase (LOX), Angiopoietin related protein 4 (ANGPTL4), Egl nine homolog 3 (EGLN3) and Adrenomedullin (ADM) in a concentration dependent manner in vitro. It also suppressed mRNA levels of VEGF, chemokine receptor type 4 (CXCR4) and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in the ischemic lung. Furthermore, the VEGF modulated reperfusion edema was significantly less pronounced in lungs and a much higher survival rate was observed for Deguelin treated animals. In addition, under Deguelin treatment, proinflammatory proteins such as ICAM-1 and CXCR4 were down-regulated and anti-inflammatory monocytes (CD 163, CD 68) were recruited to the transplanted organ.These findings were underlined by the significant higher survival rate of Deguelin treated animals compared to the untreated ones. This let us suggest that HIF-1 inhibition can improve the condition of the lung graft.