Die Etablierung massenspektrometrischer quantitativer Studien des Herzproteoms während der embryonalen Entwicklung und der Alterung

Abstract

Neue Erkenntnisse über die physiologischen, molekularen und pathologischen Prozesse im Herzen konnten im letzten Jahrzehnt anhand von Modellorganismen gewonnen werden. Die Entwicklung neuer Techniken ermöglichte außerdem die Etablierung umfangreicher und eindrucksvoller Studien basierend auf den neusten Mikroskopieverfahren, auf globalen Genexpressionsanalysen (Microarray) sowie auf modernen Massenspektrometrie (MS)- basierenden Proteinanalysen anhand von hochauflösenden Tandem-Massenspektrometern. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die quantitative Proteinanalyse des Herzens gelegt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie und der SILAC-basierenden Proteinquantifizierung sollten herzspezifische Veränderungen während der embryonalen Entwicklung sowie während der Alterung analysiert werden. Um eine robuste und hochwertige Proteinquantifizierung im Zebrafisch Danio rerio zu ermöglichen, wurde der Modellorganismus nach der SILAC-Methode mit der Isotopen-gekoppelten Aminosäure Lysin-6 markiert. Für die vollständige Markierung des Zebrafisches wurde ein SILAC-Futter speziell für larvale und adulte Fische entwickelt, das Lysin-6-markierten Zellen von S. cerevisiae, E. coli, SILAC-Mausfutter sowie Gewebe der SILAC-Maus bzw. Lysin-6-markierte Larven von D. melanogaster enthält. Die partielle (pulse) SILAC-Markierung der Fische konnte für globale Proteinstudien genutzt werden, um Markierungsraten in verschiedenen Organen und Regenerationsprozesse in der Schwanzflosse zu dokumentieren. Neben der allgemeinen Charakterisierung regenerativer Prozesse konnten Faktoren der Flossenregeneration wie Actinodin 2 und 4 identifiziert werden. Die vollständige Markierung der Zebrafische wurde in der ersten Filialgeneration (F1) mit einer Lysin-6-Inkorporation von 95% in adulten Fischen erreicht. Anschließen konnte die hohe Präzision der Proteinquantifizierung basierend auf dem SILAC-Zebrafisch als internen Standard anhand von technischen und biologischen Triplikaten bestätigt werden. Um die späte embryonale Herzentwicklung im Zebrafisch zu studieren, wurden embryonale Herzen zu den Zeitpunkten 72 und 120 hpf isoliert und mit SILAC-Embryonen als internen Proteinstandard gemischt. Anhand von 1398 Proteinen, die massenspektrometrische (LC-MS/MS) identifiziert wurden, konnte eine Anreicherung von Proteinen der DNA-Replikation und Translation zum frühen Zeitpunkt sowie eine Anreicherung von strukturellen Proteinen der Sarkomere und Calcium-bindenden Proteinen zum späten Zeitpunkt detektiert. Diese Ergebnisse beschreiben den Übergang von proliferierenden zu ausdifferenzierten Kardiomyozyten während der späten embryonalen Entwicklung. Um die Konsequenz eines entwicklungsbiologisch wichtigen Faktors bei der Herzentwicklung zu untersuchen, wurde die Expression des Proteins activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM) durch eine Morpholino-Injektion im Zebrafisch inhibiert und der resultierende Phänotyp analysiert. Auf Protein- und Transkriptebene konnte eine reduzierte Expression augenspezifischer Proteine detektiert werden, die auf eine verzögerte Differenzierung neuronaler Zellen in der Retina hinweisen. Um den herzspezifischen Phänotyp zu charakterisieren, erfolgte die Analyse isolierter embryonaler Herzen aus ALCAM-Morphanten. Die reduzierte Expression von Proteinen der Zelladhäsion und der Organisation des Cytoskeletts wie Paralemmin (PALM), dem Integrinrezeptor (itgb1b) und der GTPase Ras-like protein Rac1a konnten detektiert werden. Wahrscheinlich führt ein Funktionsverlust von ALCAM zu einer verminderten Kontrolle der Zellform sowie zu einer beeinträchtigen Koordination der Zell-Zellkontakte, da die komplexe Interaktion zwischen Transmembranproteinen, Adapterproteinen und dem Cytoskelett beeinflusst wird. Neben den entwicklungsbiologischen Fragestellungen standen in der vorliegenden Arbeit auch die Analysen von altersbedingten Veränderungen der Herzfunktion im Vordergrund. Hierfür wurden Kardiomyozyten aus jungen (2 Monate) und gealterten (22 und 30 Monate) Mäusen isoliert und für eine quantitative Proteomanalyse basierend auf der SILAC-Maus eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass Maus-Kardiomyozyten während der Alterung minimale Adaptionen im Fettsäurestoffwechsel sowie eine beeinträchtigte zelluläre Antwort auf oxidativen Stress aufweisen. Zusätzlich wurde erstmals eine altersbedingt erhöhte Expression von Proteinen identifiziert (u.a. BDH1), die am Ketonstoffwechsel beteiligt sind. BDH1 katalysiert die Synthese des Ketonkörpers Acetacetat, für den bereits eine Funktion als Antioxidanz beschreiben wurden. Daher könnte es sich hier um eine altersbedingte Schutzfunktion vor oxidativem Stress im Herzen handeln. In the last decade we gain insights of physiological, molecular and pathological processes of the heart based on the work with model organisms. In addition, the development of new techniques as imaging systems, global gene expression analyses (Microarray) and state of the art mass spectrometry (MS) based protein analyses enabled comprehensive and impressive studies. This work focus on quantitative proteome analyses of the heart. Heart specific changes during embryonic development and during aging should be analyzed by mass spectrometry and SILAC based protein quantification. For this purpose the zebrafish (Danio rerio) was SILAC-labeled with the heavy amino acid Lysin-6 to enable high quality protein quantification in this model organism. To label the zebrafish a heavy diet was developed based on Lysin-6 labeled Escherichia coli, Saccharomyce cerevisiae, larvae of Drosophila melanogaster, SILAC mouse tissue and SILAC mouse diet. Unsaturated (pulse) SILAC-labeling was employed to determine protein incorporation rates in different tissues and allowed characterization of the fin regeneration process as well as identification of newly synthesized proteins during fin regeneration (e.g. Actinodin 2 and 4).Adult zebrafish of the F1 generation showed complete labeling with a Lysin-6 incorporation of 95%. Next, the high accuracy of SILAC protein quantification in zebrafish could be demonstrated by technical and biological triplicates. To analyse the late embryonic heart development, embryos of the SILAC-zebrafish were used as an internal standard for protein quantification and mixed with non-labeled isolated embryonic hearts of 72 and 120 hpf. In total 1398 protein were quantified by mass spectrometry (LC-MS/MS) at both developmental stages. Proteins belonging to DNA-replication and translation were enriched at the early time point, whereas structural proteins of the sarcomeres and calcium-binding proteins were over represented at the later developmental stage. These findings indicate strong differentiation of subcellular structures of cardiomyocytes during the late embryonic development. To evaluate an important factor during heart development, the adhesion protein ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) was knocked down by Morpholino injection in zebrafish. Analysis of the resulting phenotype on protein and transcript level revealed a down regulation of several proteins located in the eye, suggesting a delayed development of the retina in ALCAM morphants. To focus on the heart specific phenotype the analysis was repeated using isolated embryonic hearts of ALCAM morphants. The reduced expression level of Paralemmin (PALM), the Integrin receptor beta and the Ras-like protein Rac1a were found, which are important regulators for cell adhesion and cytoskeletal reorganization. These results suggest that the depletion of ALCAM leads to reduced regulation of the cell shape and a disturbed crosstalk between transmembrane proteins, adhesion proteins and the cytoskeleton.Next to the developmental analyses this work also focus on heart specific changes during aging. For the quantitative proteome analysis, isolated cardiomyocytes of the SILAC mouse were used as an internal standard and mixed with non-labeled isolated cardiomyocytes of young (2 month) and aged (22 and 30 month) mice. The results revealed minor changes in fatty acid metabolism and impaired cellular response to oxidative stress in cardiomyocytes during aging. In addition, we found an up regulation of proteins belonging to the ketone body metabolism (e.g. BDH1) in aged hearts. BDH1 catalyse the synthesis of the ketone body Acetoacetate, which is known to be an antioxidant, suggesting a function to protect cardiomyocytes against oxidative stress during aging.