Assoziationen zwischen Mutationen ausgewählter ribosomaler Bestandteile von Brachyspira hyodysenteriae und MHK-Werten für Pleuromutiline, Makrolide und Lincosamide

Abstract

Brachyspira hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie, einer weltweit vorkommenden Durchfallerkrankung bei Mastschweinen, die zu schwerer mucohämorrhagischer Colitis und Typhlis führt. Im Falle eines Krankheitsausbruchs sind erhebliche ökonomischen Einbußen durch reduzierte Futterverwertung und Tageszunahmen zu erwarten, zudem ist mit hohen Totalverlusten zu rechnen, weshalb eine umgehende Behandlung unabdingbar ist. Mit hoch sensitiven und spezifischen diagnostischen Verfahren wie der PCR kann binnen eines Tages die Diagnose gestellt werden. Ein Resistenztest der nach guter veterinärmedizinischer Praxis der Therapie voransteht ist aktuell nur über eine relativ langwierige bakteriologische Anzucht möglich. Außerdem steht der Resistenztest für B. hyodysenteriae nicht flächendeckend zur Verfügung. Zudem werden steigende Resistenzraten gegen die derzeit effektivste Wirkstoffgruppe zur Behandlung der Dysenterie die Pleuromutiline beobachtet. In der vorliegenden Dissertation wurden 64 B. hyodysenteriae-Stämme aus deutschen Betrieben auf Mutationen mit Assoziation zu den MHK-Werten für Pleuromutiline, Makrolide und Lincosamide untersucht. Das Stammkollektiv wurde auf Tryptikase-Soja-Agar mit 5% Schafblutzusatz und 5 Selektivantibiotika angezüchtet und reinkultiviert. Anschließend wurden die MHK-Werte mit einem Mikroboulliondilutionstest (MBDT) bestimmt. Mittels PCR wurden Gene, die für Bindungsregionen der Pleuromutiline in der 23S rRNA kodieren, sowie Gene für Proteine, die unmittelbar an das Peptiyltransferasezentrum angrenzen (L3, L4, L2, L22), amplifiziert. Die Amplifikate wurden sequenziert. Durch vergleichende Analysen konnten Mutationen detektiert und Assoziationen zu MHK-Werten hergestellt werden. Von insgesamt 14 SNPs in der 23S rRNA und 4 SNPs in L3 waren 2 SNPs (L3443 in L3 und Position 2535 in der 23S rRNA) signifikant mit den MHK-Werten assoziiert. Der SNP in L3 an Position 443 führte in 27 % der Fälle zu einem Aminosäureaustausch von Asparagin (Asn) zu Serin (Ser). Dieser Austausch war signifikant mit den MHK-Werten für Tiamulin (p= 0.002) und den MHK-Werten für Valnemulin (p= 0.004) assoziiert. 73 % der L3443-Asparagin-Stämme wiesen einen MHK-Wert unterhalb von 0,625 & #956;g/ml für Tiamulin auf. 89 % der L3443-Serin-Stämme erreichten MHK-Werte oberhalb von 0,625 & #956;g/ml. Unter Einbeziehung des SNPs an Position 2535 der 23S rRNA, der in den Varianten G2535 und G2535A vorkam, ergaben sich vier Varianten, von denen drei nachgewiesen werden konnten: Asn/G2535, Asn/G2535A und Ser/G2535. Innerhalb des vorliegenden Stammkollektivs ergab sich allerdings keine weitere Aufspaltung der L3-Ser Variante. Mit der Aufspaltung der L3-Asn Variante in Asn/G2535 und Asn/G2535A, konnte hingegen ein Anteil der unerwartet sensiblen Stämme durch die offensichtlich MHK-absenkende Wirkung der G2535A Variante erklärt werden. Hierdurch stieg die korrekte Zuordnung der Stämme innerhalb der L3-Asn Gruppe von 73 % auf 79 % an. Innerhalb der G2535 Stämme konnte damit die Aussagekraft durch Einbeziehung der L3-SNPs von 77 % auf 82 % gesteigert werden. Die vierte nicht vorkommende, Variante Ser/G2535A wurde in einer spanischen Untersuchung in 3 von 18 gegen Tiamulin und Valnemulin hoch-sensiblen Stämmen nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand der 64 untersuchten B. hyodysenteriae-Stämme erstmalig ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen kombinierten Genvarianten der 23S rRNA und dem ribosomalen Protein L3 und den MHK-Werten für Pleuromutiline hergestellt werden. Die gewonnenen Erkenntnisse stehen damit für die Entwicklung neuer molekularer Resistenztests zur Verfügung. B. hyodysenteriae is the pathogenic agent of swine dysentery, a disease characterized by mucohaemorrhagic colitis and typhlitis. The disease is spread worldwide. In case of an outbreak, economic efficiency is reduced because of decreased daily weight gain, poor feed conversion, treatment expenses and increased mortality. Immediate treatment is essential. Highly sensitive and specific methods like PCR facilitate diagnostics within one day. Good veterinary practics requires resistance testing prior to treatment, which is still based on the time-consuming and elaborative cultivation of isolates, and not generally part of routine diagnostics. At the same time, the resistance of B. hyodysenteriae to the most effective drug class for the treatment of dysentery - the pleuromutilins is significantly increasing. The present thesis examined 64 German B. hyodysenteriae field strains for mutations of ribosomal RNA and proteins and associations with corresponding MIC values of the strains for pleuromutilins. Cultivation was done on trypticase soy agar with 5% sheep blood and 5 selective antibiotics. MIC values were determined using a micro bouillon dilution test (MBDT). Genes involved in binding regions of pleuromutilins in the peptidyl transferase center (23S rRNA, L3, L4, L2, L22) were amplified by PCR and sequenced. From a total of 14 SNPs in the 23S rRNA and 4 SNPs in L3, 2 SNPs (L3443 in L3 and SNP2535 in the 23S rRNA) were significantly associated with MIC values. The SNP in L3 at position 443 resulted in amino acid substitution of asparagine (Asn; 73% of isolates) to serine (Ser; 27% of isolates). This variability was significantly associated with MIC values of tiamulin (p = 0,002) and valnemulin (p = 0,004). 73% of the asparagine-L3443 strains showed MIC values less than 0.625 μg/ml for tiamulin. 89 % of the serine strains reached MIC values higher than 0.625 μg/ml. The combination of SNPs at position 2535 of 23S rRNA and L3443 resulted in four variants, three of which were found in the present batch of isolates: Asn/G2535, Asn/G2535A and Ser/G2535. Subdividing the L3-Asn variant into Asn/G2535 and Asn/G2535A led to an inproved explanation of sensitive strains among this generally resistant group of strains, pointing out the MIC-decreasing effect of the G2535A variant. Thus, the correct assignment of L3-Asn strains grew from 73% to 79%. At the same time, the corresponding assignment of G2535 strains grew from 77% to 82%. The fourth variant, Ser/G2535A, was not found in the present study. It was, however detected in a Spanish study in 3 of 18 strains, highly sensitive to tiamulin and valnemulin. Based on 64 B. hyodysenteriae field strains, the present study identified significant associations between two combined SNPs (SNP2535 of 23S rRNA and SNP443 of the ribosomal protein L3) and the MICs of Pleuromutilins. These results might contribute to future molecular testing for resistance in B. hyodysenteriae.