Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Hämolysine von Brachyspira hyodysenteriae

Abstract

Brachyspira (B.) hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie (SD). Diese Erkrankung ist weltweit verbreitet und spielt auch in Deutschland eine zunehmend größer werdende Rolle. Als bedeutungsvolle Mediatoren in der Pathogenese der Dysenterie stehen, neben anderen Faktoren, die Hämolysine des Erregers (vor allem HlyA und TlyA-C) zur Diskussion. Beispielsweise waren TlyA-Deletionsmutanten avirulent und Hämolysinextrakte von B. hyodysenteriae nach Injektion in Darmloops stark schleimhautschädigend. Die Kenntnisse zu den einzelnen Hämolysinen sind jedoch lückenhaft und durch methodische Mängel belastet. Nach Klonierung der Gene hlyA und tlyA-C in E. coli wurden bisher lediglich die Transformanten, jedoch nicht die isolierten Proteine auf hämolysierende Fähigkeiten geprüft. Dabei wurden die für die Proteine kodierenden Gensequenzen nie alleine, sondern immer in Kombination mit flankierenden Gensequenzen kloniert. Studien an exakt vom entsprechenden Gen kodierten Proteinen liegen nicht vor.Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden die Hämolysingene von B. hyodysenteriae in E. coli kloniert und die exprimierbaren Proteine nach Reinigung sowohl auf ihre Antigenität und Reaktivität mit Seren infizierter Tiere, als auch auf ihre hämolysierenden und zytotoxischen Eigenschaften gegenüber verschiedenen Säugetiererythrozyten, bzw. -zellkulturen hin untersucht. Insgesamt ließen sich acht Hämolysingene in E. coli-Zellen klonieren. Nur fünf dieser acht Transformanten (ADtlyA, ADtlyB, ADtlyC, ADhlyA und AD962) exprimierten jedoch die entsprechenden Proteine, von denen die rekombinanten Proteine rTlyA-His, rTlyB-His, rTlyC-His und rHlyA-His mittels Affinitätschromatographie über ein angehängtes Histidintag gereinigt werden konnten.Die rekombinanten Hämolysine waren zwar antigen für Kaninchen, es zeigte jedoch nur eins der experimentell infizierten Schweine eine Serokonversion gegen TlyA. In Anbetracht der Tatsache, dass die anderen experimentell infizierten Schweine keine Serokonversion zu TlyA zeigten, wäre die Untersuchung einer größeren Stichprobe notwendig um eine verlässliche Aussage über die immunmodulatorischen Effekte von TlyA treffen zu können. Bei den anderen untersuchten Hämolysinen (TlyB-C und HlyA) konnte keine Serokonversion nachgewiesen werden. Beim Wachstum auf festen Nährböden mit Blut von Rind, Schaf und Pferd bildeten die Transformanten keine Hämolyse aus. Auch führte keiner der Transformanten zu einem positiven CAMP-Phänomen. Extrakte aus den klonierten Bakterien sowie die gereinigten Hämolysine verursachten keine Hämolyse von gewaschenen Schaferythrozyten. Auch konnte keine zytotoxische Wirkung auf Säugetierzellen durch die gereinigten rekombinanten Hämolysine nachgewiesen werden. Auch weitere, entsprechend den Vorgaben aus der Literatur generierte HlyA-Transformanten (die Transformante ADfabUm, welche auch die benachbarten Gensequenzen fabG und fabF enthielt sowie die Klone ADfabG und ADfabF, welche nur die benachbarten Sequenzen fabG und fabF enthielten und ein Klon (ADhlyA ), welcher nur das hlyA-Gen ohne das Fusionsprotein ( Histidintag ) enthielt) zeigten kein, wie von Hsu et al. (2001) beschrieben, hämolysierendes Wachstum auf Blut-Agarplatten. Nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen kann somit die Frage, ob es sich bei den genannten Proteinen tatsächlich um Hämolysine handelt, nicht eindeutig beantwortet werden. Zweifel an der Funktion der bei Brachyspiren vorkommenden Proteine HlyA und TlyA-C als Hämolysine scheinen nicht ganz unberechtigt zu sein. Dennoch sind diese Proteine gute Antigene, wobei es aufgrund der fehlenden Serokonversion in Seren infizierter Tiere fraglich ist, ob hieraus eine immunrelevante Bedeutung resultiert. Brachyspira (B.) hyodysenteriae is the pathogen of Swine dysenterie (SD). This disease exists worldwide and is playing an increasing role in Germany. Beside other factors, the haemolysins (especially HlyA and TlyA-C) are discussed as significant mediators in the pathogenesis of the SD. TlyA negative mutants for example were avirulent and haemolysinextracts damaged the intestinal mucosa of mice and pigs. But so far, the literature about these items is incomplete and exhibits methodical deficiencies. After cloning of hlyA and tlyAC, only the transformants have been observed concerning their haemolytic properties, not the isolated proteins. In addition, the genes of interest have always been cloned in combination with flanking nucleotide sequences. So far, studies pertaining exclusively to the genes of interest do not exist. In this study, the haemolysin genes from B. hyodysenteriae were cloned in an E. coli recipient strain. The expressable proteins were purified and examined regarding their antigenicity, their reactivity with sera from infected pigs and their haemolytic and cytotoxic effects on different erythrocytes and cell cultures. Overall, eight haemolysin genes were successfully cloned into E. coli. Five of these transformants (ADhlyA, ADtlyA, ADtlyB, ADtlyC and AD962) expressed the haemolysinprotein and four of these proteins (rHlyA, rTlyA, rTlyB and rTlyC) were purified by affinity chromatography with an attached histidin-tag. The recombinant proteins were antigenic in rabbits, whereas only a single experimentally infected pig in our sample showed a sercoconversion to TlyA. A larger sample would be required to make a more conclusive statement regarding the immunomodulatory effects of TlyA. For the other Haemolysins(TlyB-C and HlyA) no seroconversion could be verified. During the growth on solid culture media, with erythrocytes from horses, sheeps and cattle, the transformants did not form a haemolytic phenotype and did not lead to a positive CAMPphenomenon. Extracts from the transformants and purified proteins did not cause haemolytic activity on sheep erythrocytes. Also in cell cultures with mammalian cells, the purified proteins had no cytotoxic effects.Further studies on HlyA-transformants, which were generated in accordance with the specifications of literature (ADfabUm which also possessed the flanking genes fabG and fabF, ADfabG and ADfabF which possessed the genes fabG and fabF and the transformant ADhlyA which possessed only the gene HlyA without the histidin-tag), did not present any haemolytic growth on blood agar plate even though Hsu et al. (2001) demonstrated haemolytic growth of these transformants.According to current research results at this point, the question whether the proteins are true haemolysins cannot be answered unambiguously. Reasonable doubt of the function of the proteins HlyA and TlyA-C from Brachyspira as heamolysins appears to be justified. While the proteins are good antigens in rabbits, the absence of seroconversion in sera from infected pigs indicates that the proteins may not be immunologically relevant.