Regulation des hämatopoietischen Transkriptionsfaktors RUNX1 durch die Protein-Arginin-Methyltransferase 6

Protein arginine methyltransferase 6 regulates the function of the hematopoietic transcription factor RUNX1

  • Die Bildung aller Blutzellen ist ein vielschichtiger Prozess aus Proliferation und Differenzierung der pluripotenten Stammzellen. Die Regulation der hämatopoietischen Differenzierung wird unter anderem durch ein Zusammenspiel von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren gewährleistet (Barreda & Belosevic, 2001). Der Transkriptionsfaktor RUNX1 spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von hämatopoietischen Stammzellen und eine funktionelle Veränderung von RUNX1 führt zur Ausbildung von Leukämien. In humanen Leukämien ist RUNX1 ein häufiges Ziel von chromosomalen Translokationen. Außerdem ist die Haploinsuffizienz von RUNX1 beim Menschen ursächlich für familiäre Thrombozytopenien (FPD) mit reduzierten Thrombozytenzahlen (Luddy et al., 1978; Gerrard et al., 1991). Ein knock out von RUNX1 in adulten Mäusen zu einem Defekt in der Megakaryozytendifferenzierung und zu Myelodysplasien (Growney et al., 2005; Ichikawa et al., 2004). Die Funktion von RUNX1 wird unter anderem durch die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren reguliert. Dabei kann RUNX1 die Expression von Zielgenen aktivieren oder reprimieren, abhängig davon welche Cofaktoren rekrutiert werden. Die Rekrutierung von Chromatin-modifizierenden Cofaktoren durch RUNX1 führt zur Veränderung der Chromatinstruktur und leitet epigenetische Regulationsprozesse ein. Bekannte Histon-modifizierende Interaktionspartner von RUNX1 sind p300 und HDAC1. p300 besitzt Histon-Aceyltransferase-Aktivität und führt zur Ausbildung offener Chromatinstrukturen, welche dann Transkriptionsfaktoren erlaubt an die DNA zu binden und somit zur Aktivierung der Expression von Zielgenen beiträgt (Vogelauer et al., 2000). Der Gegenspieler von Acetyltransferasen sind Histon Deacetylasen (z.B. HDAC1), welche Acetylgruppen entfernen und somit reprimierend auf die Genexpression wirken (Berger, 2007). Bestimmte Zelltypen unterscheiden sich stark voneinander trotz eines gemeinsamen genetischen Codes. Die Expression von zelllinienspezifischen Genen muss daher zelltypspezifisch kontrolliert werden. Dies geschieht durch epigenetische Regulationsvorgänge, welche stammzell-spezifische Gene abschalten, wohingegen zelllinienspezifische Gene angeschaltet werden. Neben der Acetylierung von Histonen ist die Methylierung eine häufige posttranslationale Modifikation, die im Histone Code eine wichtige Rolle spielt. Diese Histonmarkierung wird von Methyltransferasen katalysiert. Die epigenetische Regulation von RUNX1-Zielgenen während der Differenzierung von Vorläufer-/Stammzellen wurde bislang noch nicht näher aufgeklärt. Aus diesem Grund sollten neue Interaktionspartner von RUNX1 mit epigenetischer Funktion identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion von RUNX1 mit der Protein Arginin Methyltransferase 6 (PRMT6) gezeigt werden. Expressionsanalysen wiesen eine Expression von RUNX1 und PRMT6 in Stamm-/Vorläuferzellen nach. Während der Megakaryozytendifferenzierung verhielt sich das Expressionsmuster von PRMT6 gegensätzlich zu der RUNX1-Expression. Zur Überprüfung der Auswirkung von PRMT6 auf die Megakaryozytendifferenzierung, wurden ein knock down sowie eine Überexpression von PRMT6 durchgeführt. Die veränderte CD41-Expression einer Beeinflussung des PRMT6-Levels deutet auf einen reprimierenden Effekt von PRMT6 auf die Megakaryopoiese hin. Das daran anschließende Ziel bestand in dem Nachweis der kooperativen Regulation von differenzierungsspezifischen Genen durch PRMT6 und RUNX1. PRMT6 konnte als Teil eines RUNX1-Corepressorkomplexes mit Sin3a und HDAC1 auf dem Promotorbereich von RUNX1-Zielgenen in hämatopoietischen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Ein in vitro Methyltransferaseassay lieferte Hinweise darauf, dass RUNX1 am Arginin 307 von PRMT6 methyliert wird, was zu einer verstärkten Interaktion beider Faktoren, einer verminderten Aktivierungsfähigkeit und einer erhöhten DNA-Bindungskapazität von RUNX1 führt. Außerdem konnte eine Methylierung des H3R2 am Promotor von megakaryozytären Genen durch PRMT6 gezeigt werden, welche die Bindung des WDR5/MLL-Komplexes an die H3K4me2 Markierung verhindert und somit eine Trimethylierung von H3K4 inhibiert (Hyllus et al., 2007). Auf dem Promotorbereich ist neben den reprimierenden Histonmodifikationen H3R2me2 und H3K27me3 die aktivierende H3K4me2+/me3-Histonmodifikation, sowie die initiierende RNA-Polymerase II vorhanden. Die Gene befinden sich in einem Zwischenzustand (intermediary state) und werden basal transkribiert. Während der Differenzierung in Richtung Megakaryozyten konnte ein Austausch des Corepressorkomplexes gegen einen Coaktivatorkomplex mit p300, PCAF, WDR5, PRMT1 und GATA1/FOG1 beobachtet werden. Ein Verlust von PRMT6 führte zu einer Verringerung der H3R2me2 Markierung. Dadurch konnte WDR5 an den Promotor binden und die H3K4-Trimethylierung wurde durch den WDR5/MLL-Komplex katalysiert. Zusätzlich konnte eine Acetylierung des Promotorbereiches und die Belegung des Promotorbereiches mit der elongierenden RNA-Polymerase II, phosphoryliert am Serin 2, nachgewiesen werden, was zur Induktion der Expression der megakaryozytären Gene führte. Zusammenfassend konnte PRMT6 als neuer Interaktionspartner von RUNX1 identifiziert werden, welcher durch die H3R2-Methylierung differenzierungsspezifische Gene in einem Zwischenzustand hält und reprimierend auf die Megakaryozytendifferenzierung wirkt. Die Expression der intermediary state Gene kann während der Differenzierung schnell aktiviert werden. Zusätzlich konnte eine Methylierung von RUNX1 durch PRMT6 gezeigt werden.
  • The differentiation process from stem cells to mature cells is controlled by a cell-specific transcriptional network, in which transcription factors activate or repress genes according to the lineage differentiation program of a given cell. This program is regulated by external signals, which influence the activity of transcription factors and the status of chromatin (Barreda & Belosevic, 2001). The transcription factor RUNX1 plays a central role in hematopoiesis and angiogenesis and its activity is altered by mutations, deletions and chromosomal translocations in leukemia. RUNX1 is required for the emergence of adult hematopoietic stem cells (HSC) during embryonic development and for proper lineage differentiation from HSC to mature blood cells. Haploinsufficiency of RUNX1 causes familial platelet disorders in humans (FPD/AML) (Luddy et al., 1978; Gerrard et al., 1991). Furthermore, a deletion of RUNX1 leads to an impairment of platelet formation and megakaryocyte differentiation (Growney et al., 2005; Ichikawa et al., 2004). The function of RUNX1 is regulated by interaction with several transcription factors and cofactors. RUNX1 is capable to function as a repressor or as an activator. So far mSin3a and HDACs (histone deacetylase) have been identified as RUNX1 co-repressors. RUNX1 can also recruit co-activator proteins like p300/CBP to regulatory elements of genes and activate their expression (Kitabayashi et al., 1998; Wang et al., 2009). Hematopoietic cell differentiation involves extensive reorganization of chromatin, but chromatin modifications like histone modifications also contribute to the maintenance of a stable expression pattern in the stem cell or terminally differentiated cells. RUNX1 is an important transcription factor for the epigenetic state of target genes during hematopoietic differentiation by recruiting cofactors (Yoshida & Kitabayashi, 2008). Protein arginine methyltransferases (PRMTs) are a new family of enzymes that catalyse the methylation of arginines on non-histone and histone proteins and thereby contribute to the histone code (Bedford, 2007). We identified protein arginine methyltransferase 6 (PRMT6) as a new interaction partner of RUNX1. RUNX1 is methylated by PRMT6 and there is some evidence that this methylation influence the interaction of RUNX1 with PRMT6 and the transactivation capacity of RUNX1. PRMT6 is recruited to RUNX1 target gene promoters in hematopoietic progenitor cells and is part of a histone modification complex. We found that PRMT6 is responsible for histone H3 arginine-2 dimethylation (H3R2me2) that represses H3K4me3 but does not effect H3K4me2. This keeps the promoter in a repressed but poised state for transcriptional activation. During megakaryocytic differentiation PRMT6 is down regulated, the repressive histone marks are removed and transcription of RUNX1 target genes is induced. Our results provide novel mechanistic insight into how RUNX1 activity in hematopoietic progenitor cells maintains differentiation genes in a suppressed state but poised for rapid transcriptional activation.

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Metadaten
Author:Julia Herglotz
URN:urn:nbn:de:hebis:30-115026
Referee:Rolf MarschalekORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/09/09
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2011/09/05
Release Date:2011/09/09
Tag:Posttranslationale Modifikationen; Protein Arginin Methyltransferase; RUNX1; intermediate state
Hematopoetic differentiation; epigenetic regulation; intermediate state; transkription factor
GND Keyword:Transkriptionsfaktor; Epigenetik; Hämatopoese
HeBIS-PPN:27455187X
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht