Authors:	Kasper, Jennifer Yvonne
Title:	Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract
Online publication date:	22-Dec-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellulärer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabhängige Endozytose (mit möglicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gewählt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse für biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel für pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten über Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfläche für gesundheitsschädliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitsschädigenden Risiken, sowie das Schicksal von zellulär aufgenommenen NPs sorgfältig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umständlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvasculären Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausgesät werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausgesät werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare Nähe von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend für durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Ausschüttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Ausschüttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ähnliche epitheliale Eigenschaften einer schützenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gewählten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilität (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabhängig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen für alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen höheren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird ermöglicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekräftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bezüglich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Ausschüttung sensitiver auf z.B. TNF- oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizelluräre Kokulturmodelle viel präziser das zelluläre Zusammenspiel im Körper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro- Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bezüglich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher möglich war. In this study cytotoxicity and inflammatory responses of the lower respiratory tract following nanoparticle (NP) exposure were investigated. Special attention was also given to cellular uptake mechanisms, such as clathrin- or caveolae-mediated as well as clathrin- or caveolae-independent endocytosis pathways (possible involvement of flotillins) to evaluate specific entry routes for NPs. Three different types of NPs were chosen: amorphous silica (aSNP), organosiloxane (AmorSil) and poly(ethyleneimine) (PEI). All three NPs are gaining increasing interest for biomedical research (drug and gene delivery). In particular, aSNPs are widely used for industrial applications. Hence, attention has to be given to possible health hazards of inhalation of these NPs. The alveolar region of the lung, with a surface area of 100-140 m2, makes it an interesting target for drug and gene delivery, but at the same time it represents a serious area of attack for harmful nanomaterials. For that reason, toxic effects and the cellular pathways of internalized NPs should be addressed if a lung application is envisaged. The alveolar-capillary barrier of the deep lung is difficult to access by in vivo studies. Therefore, a coculture model that mimics the alveolar-capillary barrier in vitro has been established. The model consists of human lung epithelial cells (cell line NCI H441) and human microvascular endothelial cells (cell line ISO-HAS-1), on opposite sides of a transwell filter unit. NCI H441 differentiate to a polarized, barrier-forming epithelial layer. The tight barrier developed can be measured, for example, by transepithelial resistance (TER). NP interaction with cells in coculture was compared to interaction with the conventional monoculture, in which the cells are seeded on tissue culture plastic 24h prior to the experiment. This study demonstrates that not only the polarized nature of cells in coculture but also the close proximity of epithelial and endothelial cells plays an important role in the effects caused by aSNP exposure. With regard to inflammatory responses the coculture behaves more sensitively after aSNP exposure, i.e. sICAM, IL-6 and IL-8 release, than cells kept under conventional monoculture. On the other hand, the epithelial layer in coculture is more resistant than the conventional monoculture with regard to LDH release after aSNP treatment. Uptake studies revealed that the epithelial cells in coculture take up NPs to a much lesser extent than the cells in conventional monoculture. Thus, NCI H441 in coculture show an epithelial character similar to the tight, protecting barrier found in vivo. Although sufficient uptake of NP to NCI H441 in coculture was induced, transport of NPs through the epithelial layer and subsequent uptake in the endothelial layer was not detected within the chosen exposure times. In both mono- and coculture uptake mechanisms mediated by clathrin- or caveolae-dependent mechanisms could not be revealed using immunofluorescence. However, an accumulation of NPs in flotillin-1- and -2-containing vesicles was detected in the epithelial cells of both culture systems. Studies using flotillin-depleted epithelial cells showed a clearly decreased uptake of aSNPs. Additionally, the viability of cells after aSNP exposure was reduced. These findings indicate a contribution of flotillins in as yet unknown (clathrin or caveolae-independent) endocytosis mechanisms and (or) endosomal storage. In summary, although barrier properties differ considerably, uptake mechanisms were comparable between conventional monoculture and coculture for all NPs investigated. Nevertheless, toxicity studies should be carried out with cocultures, as the tight, protecting barrier is similar to the in vivo situation. This study clearly showed that the behaviour of cells alters when they are kept under coculture conditions. Cells reach a higher differentiation state and cell communication with other relevant cell types is possible. Adding a third relevant cell type to the coculture, the alveolar macrophage (cell line THP-1), which represents the first line of defence in the alveolus, corroborated these findings. Preliminary tests showed that this triple-culture reacted even more sensitively than the co-culture with changes in barrier function or IL-8 release upon stimulation with TNF-a (tumor necrosis factor ), LPS (lipopolysaccharide) or aSNPs. Compared to conventional monocultures, well designed multicellular culture models more closely mimic the cellular composition in the human body. Hence, nanoparticle interaction with the triple-culture model in vitro may predict effects of NP environmental exposure or drug and gene delivery to the deep lung more precisely than has been possible up to now.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2139
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-29726
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	150 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen