Authors:	Wenzel, Gregor R.
Title:	CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients
Online publication date:	16-Dec-2013
Year of first publication:	2013
Language:	english
Abstract:	Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist. In relapsed leukaemia patients having undergone allogeneic haematopoietic stem cell transplantation, donor lymphocyte infusions (DLI) can induce durable complete remissions. T cells in the DLI mediate the potentially curative graft-versus-leukaemia effect as well as the potentially life-threatening graft-versus-host-disease (GVHD). Administration of leukaemia-reactive T cells could provide a selective graft-versus-leukaemia effect and longterm protection from relapse due to immunological memory directed against the malignancy. Our group developed protocols for the in vitro generation of leukaemia-reactive T cells that show high cytolytic activity against acute myeloid leukaemia (AML) with minimal recognition of possible GVHD targets. For translation to clinical application a protocol for the fast generation of sufficiently high T cell counts for adoptive transfer within approximately three weeks are needed. The shortening of the culture period could yield T cells of a central memory or early effector phenotype that have been shown to exhibit better in vivo effector function and persistence compared to T cells from prolonged culture. The activation marker and costimulatory receptor CD137 can be used to detect and isolate antigen-specific T cells without knowledge of the exact antigenic peptide. A CD137 enrichment step with clinical grade reagents could be an efficient in vitro means to improve the production of leukaemia-reactive T cells resulting in increased numbers of antigen-specific T cells not only due to positive isolation but also costimulation during early culture periods. In this MD thesis mixed lymphocyte leukaemia cultures with CD8 T cells of healthy donors and HLA-matched or single HLA-allele-mismatched AML blasts were generated and restimulated weekly. After two weeks leukaemia-reactive T cells were positively selected by CD137 12 h after restimulation and cultured subsequently. The isolated fractions and unseparated controls were tested in ELISPOT and chromium release assays on day 5 after restimulation. No consistent major advantages were found concerning growth and functionality of the isolated CD137 positive fractions compared to the unseparated controls. Different isolation-methods, patient-donor-systems, modes of restimulation, temperature conditions, cytokine combinations and modes of cytokine administration as well as additional feeder cells or AML blasts after isolation did not substantially influence growth, functional data and the considerable cell loss during the isolation procedure. Live/death cell staining assays showed that activation induced cell death of CD137 positive T cells could contribute to the results. As a major difference to AML blast-stimulation, successful CD137 enrichment has been reported for peptide-stimulated T cells. Different CD137 kinetics, activation induced cell death and regulatory T cells are potential factors that could make CD137 enrichment an unsuitable method in the context of AML blast stimulation. The stimulatory effect of CD137 signals in tumour-reactive CD8 T cells was compared using CD3/CD28 and CD3/CD28/CD137 antibody coated magnetic beads. In renal cell carcinoma-reactive T cells CD3/CD28/CD137 beads were equally efficient as tumour stimulator cells and more efficient than CD3/CD28 beads. Both kinds of beads were suitable for stimulation during the first weeks of culture, so the additional CD137 signal could be useful for clinical grade expansion of tumour-reactive T cells. The bead expansion did not alter antigen-induced IFN-secretion in the ELISPOT assay, but caused moderate impairment of cytotoxicity as measured by chromium release assay. In contrast in AML-reactive CD8 T cells both kinds of beads showed a non-apoptosis-mediated, dose-dependent adverse effect, that led to a rapid decline in cell counts of bead-exposed T cells. Adverse effects of bead-stimulation on T cell functionality have been reported in the literature, however currently no publications are available that could provide a well-founded explanation for the effect in AML-reactive T cells. Despite literature data suggesting that CD137 might be a promising candidate for enrichment and expansion of AML-reactive T cells, the overall data on CD137-isolation as well as on bead-stimulation indicate that in this specific setup CD137 may be an unsuitable activation marker and costimulatory ligand.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1785
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-35803
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	114 S.
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