Authors:	Kühne, Christoph Wolf
Title:	3D cryo-electron microscopy and molecular model of two arthropod hemocyanins
Online publication date:	9-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	This work presents 3D-reconstructions of two arthropod hemocyanin molecules produced by single particle cryo-EM. The 3D-reconstruction of the 8x6mer hemocyanin of the horseshoe crab Limulus polyphemus was built upon a newly acquired dataset under oxygenated conditions and improved the previous results. The achieved resolution of 8,7 Å (0,5 criterion) allowed for further refinement of the existing molecular model by flexible fitting into the 3D density map. Also newly available additional authentic sequences of Limulus polyphemus hemocyanin as well as a more suitable source for homology models of subunits with unknown sequence remaining were used to update the molecular model and verify previously identified interface sites and in turn molecular mechanisms of cooperativity by chemo-mechanical signal transduction. Compared to a conventional rigid body fitting, the secondary structure aware flexible fitting algorithm especially improved the overall fit in domain #1 of each subunit, which contains mainly well resolved α-helices. Domain #2 also contains α-helices as well as the active site. Changes in this region were generally less frequent with the active site left intact. Domain #3 is mainly comprised of β-sheets which lead to few discernible improvements as the observed level of detail contained within the reconstruction was insufficient to provide clear target masses for the fitting algorithm. Secondly both coarse and fine structural details of the 4x6mer hemocyanin of the ghost shrimp Callianassa truncata were revealed by an unbiased reference-free reconstruction method yielding a resolution of 9,8 Å (0,5 criterion). In combination with available sequence data, a molecular model of the 4x6mer was constructed. This revealed a total of twelve contact points facilitated by four distinct types of interface. Most contacts are densely packed in the center of the 4x6mer. The interfaces are the sites of interaction between the hexamers, both in terms of stabilization of the quaternary structure of the molecule as well as possible ways for chemo-mechanical signal transduction. Overall there are three subunits involved in contacts with subunit b of type CtrHc2 participating in every contact but one. This indicates its importance to the assembly of the 2x6mers and 4x6mer. Also, in combination with published low-resolution 3D-reconstrcutions of crustacean 2x6mers, insight into the evolutionary development of crustacean hemocyanin was gained. Die vorgelegte Arbeit zeigt zwei 3D-Rekonstruktionen von Arthropoden-Hämocyaninen mittels Einzelpartikelanalyse nach Cryo-Elektronenmikroskopie. Die 3D-Rekonstruktion des 8x6meren Hämocyanins des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus konnte mit einem neuen Datensatz unter oxygenierten Bedingungen frühere Ergebnisse verbessern. Die erreichte Auflösung lag bei 8,7 Å (0,5 Kriterium), was eine Verfeinerung des existierenden molekularen Modells durch flexibles Einpassen in die 3D-Dichtekarte ermöglichte. Das molekulare Modell wurde darüber hinaus mit zusätzlichen authentischen Sequenzdaten sowie besser geeigneten Sequenzvorlagen für Homologiemodelle der Untereinheiten mit unbekannter Sequenz auf den neuesten Stand gebracht. Die zuvor postulierten Mechanismen der Kooperativität durch chemo-mechanischen Signalübertragung konnten damit bestätigt werden. Verglichen mit einem konventionellen rigidem Einpassen des molekularen Modells in die 3D-Dichtekarte konnte der Algorithmus für das flexible Einpassen, welcher Sekundärstrukturelemente berücksichtigte, die Übereinstimmung in Domäne #1 jeder Untereinheit verbessern. Diese Domäne besteht hauptsächlich aus gut aufgelösten α-Helices. Domäne #2, welche ebenfalls viele α-helikale Bestandteile sowie das aktive Zentrum enthält, wurde weniger häufig verändert. Dabei blieb das Sauerstoffbindungszentrum intakt. Domäne #3 besteht zum Großteil aus β-Faltblättern, welche in der 3D-Rekonstruktion nicht ausreichend Details boten, um dem Algorithmus klare Massen als Ziele für die flexible Einpassung zu bieten. Zweitens konnten sowohl der makromolekulare Aufbau als auch strukturelle Details mit der 3D-Rekonstruktion des 4x6meren Hämocyanins von Callianassa truncata mittels einer nicht durch Vorgaben beeinflussten Rekonstruktionsmethode erforscht werden. Die 3D-Rekonstruktion erreichte eine Auflösung von 9,8 Å (0,5 Kriterium).In Kombination mit vorliegenden Sequenzdaten konnte ein molekulares Modell des 4x6mers erstellt werden. Insgesamt wurden zwölf Kontaktstellen, aufgeteilt auf vier verschiedene Kontaktarten, gefunden. Fast alle Kontakte sind dicht gepackt im Zentrum des Moleküls zu finden. Diese Kontaktstellen sind für den Zusammenhalt der Quartärstruktur und möglicherweise ebenfalls für eine chemo-mechanische Signalübertragung verantwortlich. Drei Untereinheiten sind in Kontakte involviert, wobei die Untereinheit b vom Typ CtrHc2 an drei der vier Kontakttypen beteiligt ist. Dies ist ein Zeichen für ihre Wichtigkeit bei der Assemblierung der 2x6 und 4x6mere. In Kombination mit publizierten, niedrig aufgelösten 3D-Rekonstruktionen von Crustaceen-2x6meren konnten neue Erkenntnisse über die evolutionäre Entwicklung der Crustaceen-Hämocyanine gewonnen werden.
DDC:	590 Tiere (Zoologie) 590 Zoological sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4589
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008693
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIII, 173 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen