Chorea Huntington (HD) ist eine vererbte, fortschreitend verlaufende neurodegenerative Krankheit, die durch eine verlängerte Polyglutaminkette am N-Terminus des Proteins Huntingtin verursacht wird. Der Pathomechanismus von HD sowie die normale Funktion von Huntingtin sind unklar. HD Exon 1 Proteine mit einer Glutaminkettenlänge im krankhaften Bereich (> 37 Glutamine) bilden in vitro Proteinaggregate. Außerdem wurde die Anhäufung von unlöslichen, Polyglutamin-enthaltenden Proteinaggregaten in Hirnen von HD transgenen Mäusen und Patienten detektiert, was zu der Hypothese führte, daß HD durch die Bildung von Proteinaggregaten in neuronalen Einschlußkörpern verursacht wird. Um die Aggregation von Huntingtin genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit stabile, induzierbare 293 Tet-Off Zelllinien hergestellt, die HD Exon 1 Proteine mit 20, 51 und 83 Glutaminen produzieren. In diesem Zellmodell bilden Huntingtin Exon 1 Proteine mit einer Glutaminkettenlänge im krankhaften Bereich (51 und 83 Glutamine), aber nicht mit einer Kettenlänge im normalen Bereich (20 Glutamine), perinukleare Einschlußkörper. Diese Strukturen enthalten aggregiertes, ubiquitiniertes Huntingtin Exon 1 Protein mit einer fibrillären Morphologie. Die Einschlußkörper werden an Centrosomen gebildet und von dem Intermediärfilament Vimentin umhüllt. Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie zeigten, daß die 20S, 19S und 11S Untereinheiten des 26S Proteasoms, die molekularen Chaperone BiP, Hsp70 und Hsp40 sowie das RNA- bindende Protein TIA-1, das potentielle Chaperon 14-3-3 und a-Synuclein mit den perinuklearen Einschlußkörpern colokalisieren. Die Inhibierung der proteasomalen Aktivität führte zu einem zweifachen Anstieg der Aggregatmenge, was zeigt, daß sich die Einschlußkörper anhäufen, wenn die Kapazität des Ubiquitin-Proteasom Systems erschöpft ist. In den 293 Tet-Off Zellen führte die Bildung der Einschlußkörper auch zu Zelltoxizität und ultrastrukturellen Veränderungen wie Einbuchtungen und Unterbrechungen in der Kernmembran. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, daß HD Exon 1 Fragmente unter normalen Bedingungen vom Proteasom abgebaut werden. HD Exon 1 Fragmente mit einer langen Polyglutaminkette polymerisieren jedoch und widerstehen dem Abbau; sie rekrutieren sogar noch zusätzliche Proteine zu den Einschlußkörpern und bilden das "Degrasom". Um etwas über die normale Funktion von Huntingtin zu erfahren, haben wir mit dem Hefe Two-Hybrid System nach Huntingtin- interagierenden Proteinen gesucht und dabei das Huntingtin interagierende Protein 1 (HIP1) identifiziert. Hier wird gezeigt, daß HIP1 ein Multidomänenprotein ist, das eine N-terminale ENTH-Domäne, eine zentrale coiled-coil-bildende Region und eine C-terminale Actin-bindende Domäne enthält. Mittels Affinitätschromatographie wurden drei HIP1 assoziierte Proteine identifiziert: die schwere Kette von Clathrin, a-Adpatin A und C. In vitro Bindungsstudien zeigten, daß die zentrale coiled-coil-bildende Domäne für die Interaktion von HIP1 mit Clathrin benötigt wird, während DxF-Motive, die vor dieser Domäne liegen, für die Bindung von HIP1 an die C-terminale "Appendage"-Domäne von a-Adaptin A und C wichtig sind. Die Expression des vollständigen HIP1 in Säugetierzellen ergab eine punktförmige, cytoplasmatische Immunfärbung, die für Clathrin-bedeckte Vesikel charakteristisch ist. Wenn ein verkürztes HIP1 Protein überexprimiert wurde, das die DxF-Motive und die coiled-coil Domäne enthält, wurden jedoch große, perinukleare vesikelartige Strukturen beobachtet, die HIP1, Huntingtin, Clathrin und internalisiertes Transferrin enthielten, was darauf hinweist, daß HIP1 ein endocytotisches Protein ist. Die strukturelle Vollständigkeit von HIP1 scheint somit für die Erhaltung der Vesikelgröße in vivo entscheidend zu sein.
Huntington`s Disease (HD) is an inherited, progressive neurodegenerative disorder caused by an elongated polyglutamine repeat located at the N-terminus of huntingtin. The pathomechanism of HD as well as the normal function of huntingtin are unclear. HD exon 1 proteins with a polyglutamine tract in the pathological range (> 37 glutamines) form protein aggregates in vitro. In addition, the accumulation of insoluble polyglutamine-containing protein aggregates in intranuclear and perinuclear inclusions has been detected in brains of HD transgenic mice and HD patients, leading to the hypothesis that HD is caused by the accumulation of protein aggregates in neuronal inclusions. To study the aggregation of huntingtin in more detail, stable, inducible 293 Tet-Off cell lines producing HD exon 1 proteins with 20, 51 and 83 glutamines were established in this work. In this cell model, the huntingtin exon 1 proteins with a polyglutamine tract in the pathological range (51 and 83 glutamines), but not in the normal range (20 glutamines), form perinuclear inclusions. These structures contain aggregated, ubiquitinated huntingtin exon 1 protein with a fibrillar morphology. The inclusion bodies are formed at centrosomes and are surrounded by vimentin filaments. Immunofluorescence and electron microscopy revealed that the 20S, 19S and 11S subunits of the 26S proteasome, the molecular chaperones BiP, Hsp70, and Hsp40 as well as the RNA- binding protein TIA-1, the potential chaperone 14-3-3, and a-synuclein colocalize with the perinuclear inclusions. Inhibition of the proteasome activity resulted in a 2-fold increase in the amount of aggregates, indicating that the inclusion bodies accumulate when the capacity of the ubiquitin- proteasome system is exhausted. In 293 Tet-off cells, inclusion body formation also resulted in cell toxicity and ultrastructural changes such as indentations and disruption of the nuclear envelope. Together these findings suggest, that under normal conditions mutant HD exon 1 fragments are transported to the proteasome for proteolytic digestion. HD exon 1 fragments with a long polyQ repeat polymerize and resist degradation, instead recruiting additional proteins to the inclusion bodies and forming the "degrasome". To gain insight into the normal function of huntingtin we have screened for huntingtin interacting proteins using the yeast two-hybrid system and discovered the huntingtin interacting protein 1 (HIP1). It is shown that HIP1 is a multidomain protein containing an N-terminal ENTH domain, a central coiled-coil forming region and a C-terminal actin-binding domain. By affinity chromatography three HIP1 associated proteins were identified, clathrin heavy chain, a-adaptin A and C. In vitro binding studies revealed that the central coiled-coil domain is required for the interaction of HIP1 with clathrin, whereas DxF-motifs located upstream to this domain are important for the binding of HIP1 to the C-terminal "appendage" domain of a-Adaptin A and C. Expression of full-length HIP1 in mammalian cells resulted in a punctate cytoplasmic immunostaining characteristic of clathrin-coated vesicles. In contrast, when a truncated HIP1 protein containing both the DxF-motifs and the coiled-coil domain was overexpressed, large, perinuclear vesicle-like structures containing HIP1, huntingtin, clathrin and internalized transferrin were observed, indicating that HIP1 is an endocytic protein. The structural integrity of HIP1 seems to be crucial for the maintenance of a normal vesicle size in vivo.
