Das Hormon AVP reguliert die Wasserrückresorbtion in den Prinzipalzellen renaler Sammelrohre. Die Bindung von AVP an den V2-Rezeptor führt zur Stimulation der cAMP-Bildung und somit zur Aktivierung der PKA, die im folgenden AQP2 phosphoryliert. AQP2 wird daraufhin an die apikale Zellmembran lokalisiert. Durch AQP2 in der Zellmembran kann Wasser aus dem hypotonen Urin reabsorbiert werden. Neben der Aktivität der PKA ist auch deren Verankerung über AKAP eine Voraussetzung für die AQP2-Translokation. Auf der Suche nach dem oder den beteiligten AKAP konnte im Rahmen dieser Arbeit mit AKAP18δ eine weitere AKAP18-Isoform kloniert und charakterisiert werden. So konnte die Expression von AKAP18δ in IMCD-Zellen in Western Blot-Analysen und nach einer Immunpräzipitation mit dem Antikörper A18d3 in einem RII-Overlay nachgewiesen werden. Die in vivo AKAP Funktion konnte zum einen durch cAMP-Agarose- Präzipitation und zum anderen in lebenden Zellen mit Hilfe der FRET-Technik nachgewiesen werden. Mit Hilfe der FRET-Technik konnte der inhibitorische Effekt des Peptides S-Ht31 auf die AKAP18δ-CFP-RIIa-YFP-Interaktion in vivo gezeigt werden. Die Einführung eines Prolins in die RII-Bindungsdomäne von AKAP18δ-CFP verringerte die FRET-Ratio. Dadurch konnte die RII-Bindungsdomäne in vivo eingegrenzt werden. Im Hinblick auf die AVP-vermittelten AQP2-Translokation deuten mehrere Ergebnisse auf eine Beteiligung von AKAP18d hin. So wird AKAP18δ ebenso wie AQP2 in den IMCD-Zellen in der HS-Fraktion exprimiert. Auch die stärkere Expression von AKAP18δ in der inneren Medulla im Vergleich zu dem restlichen Nierengewebe deutet auf eine mögliche Beteiligung an der AQP2-Translokation hin. Vor allem jedoch zeigt die AVP-induzierte Abnahme der AKAP18δ-RII-Interaktion, dass AKAP18δ an der AVP-vermittelten Signalkaskade beteiligt ist.
The hormon AVP regulates the water reabsorption in renal collecting duct principal cells. The binding of AVP to the V2R elevates cAMP levels, resulting in activation of the PKA. PKA phosphorylates AQP2, thereby inducing its translocation from intracellular vesicles into the apical membrane, facilitating water reabsorption. Not only the phosphorylation of AQP2 by PKA but also the tethering of PKA to subcellular compartments by AKAPs is a prerequisite for the AQP2-translocation. During the search for AKAPs involved in the AQP2-translocation, a new splice variant of AKAP18, AKAP18δ, was identified. AKAP18δ is expressed in IMCD cells. This was shown by Western blot analyses and by immunoprecipitation with the A18d3. The in vitro AKAP function was shown in an RII overlay experiment. The in vivo AKAP function was shown by co-precipitation of AKAP18δ with the RII subunits via cAMP agarose pull down and by FRET experiments in living cells. In FRET experiments it was also possible to show the inhibitory effect of the peptide S-Ht31 for the AKAP18δ- CFP-RIIa-YFP interaction. The introduction of a prolin in to the RII binding site of AKAP18δ-CFP lead to a decrease in FRET ratio, thereby mapping the RII binding site in vivo. Several results lead to the hypothesis that AKAP18δ is involved in the AVP-induced AQP2-translocation. Both, AQP2 and AKAP18δ, are in the kidney mainly expressed in the inner medulla an in the IMCD cells mainly in the HS fraction. In cAMP-agarose precipitates from AVP-stimulated IMCD cells the amount of AKAP18δ was lower than obtained from unstimulated cells. This result indicates the involvement of AKAP18δ in the AVP-induced signal pathway. The data provide evidence for an involvement of AKAP18δ in the AVP- induced AQP2-translocation by anchoring PKA in close proximity to its substrate AQP2.
