Der Cellanalyser der 530 Serie (CA530, Fa. Boule Medical, Stockholm, Schweden) ist in der humanmedizinischen Labordiagnostik bereits seit 1997 erfolgreich im Einsatz. Mit dem getesteten Gerät CA530-VET befindet sich seit 2000 die veterinärmedizinische Ausführung auf dem Markt. Ziel dieser Arbeit war die Überprüfung der Einsatzfähigkeit des CA530-VET Modell ODEN für die automatische Analyse von Blutproben der Tierarten Hund, Katze und Pferd. Im Rahmen der unter Klinikbedingungen durchgeführten Studie erfolgte außer der Ermittlung der Zuverlässigkeit der Messergebnisse auch eine Bewertung der Praxistauglichkeit für die Veterinärmedizin. Der zur Gruppe der so genannten low-end-unit-Geräte gehörende vollautomatische Hämatologieanalyser (Impedanzmessprinzip) ermittelt 16 Parameter, inklusive einer Differenzierung der Leukozyten in 3 Populationen. Als Referenzgerät zur Überprüfung der Richtigkeit diente der CELL-DYN 3500 (Fa. Abbott Laboratories, Illinois, USA; Impedanzmessprinzip kombiniert mit Streulichtmessung). Für die Parameter Hämatokrit (HKT), die Thrombozytenzahl (PLT) bei Pferd und Katze sowie die Leukozytendifferenzierung wurden als Standardmethoden die Mikrozentrifugationsmethode, die doppelte Kammerzählung (Thrombo Plus, Fa. Sarstedt, Neubauer Zählkammer) und die manuelle Differenzierung zweier nach Pappenheim gefärbter Blutausstriche mit jeweils 100 gezählten Zellen als Referenz herangezogen. Es wurden innerhalb eines Jahres in der Klinik und Poliklinik für kleine Haustiere mindestens 1/2 h bis maximal 4 h alte Blutproben der Tierarten Hund (n = 242), Katze (n = 166) und Pferd (n = 144) (gesunde und kranke Tiere) untersucht. Überprüft wurden Blutverschleppung, Präzision und Richtigkeit. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Statistikprogrammes SPSS 11.0 für Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Beurteilt wurden die Ergebnisse sowohl anhand der Richtlinie der Bundesärztekammer (BÄK) zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (2001) als auch anhand der von KLEE (1990) aufgestellten Leistungsziele für die interne Qualitätskontrolle von Mehrkanalhämatologieanalysern. Die Verschleppung der Blutzellen und des Hämoglobins im Gerät wurde mittels Kontrollblut hoher und niedriger Konzentration überprüft durch Berechnung der Carry-Over-Ratio [K %] nach der Formel von BROUGHTON et al. (1969). Die Bestimmung der Präzision in Serie (Kurzzeitstabilität) erfolgte durch 10fach-Messung von je 5 Blutproben pro Tierart, die Präzision der Wiederholungsmessung wurde anhand einer Doppelbestimmung der 550 Proben aus dem Methodenvergleich ermittelt. Die Langzeitstabilität wurde als Präzision des an jedem Messtag analysierten Kontrollblutes (Para 12 Plus, Streck Laboratories, La Vista, USA) errechnet. Zur Überprüfung der Richtigkeit der Messergebnisse des CA530-VET anhand des Gerätevergleichs mit dem CELL-DYN 3500 bzw. des Vergleiches mit den manuellen Standardmethoden wurden die einzelnen Differenzen der Messergebnisse der Geräte bzw. Methoden berechnet und modifiziert nach BLAND und ALTMAN (1986) in Beziehung zum Wert der Referenzmethode gesetzt. Zur Bewertung wurden die Messdifferenzen in prozentuale Messabweichungen der Ergebnisse des Testgerätes von den Werten der Referenzmethode umgerechnet und mit den in der Richtlinie der BÄK (2001) angegebenen Grenzen für die maximal zulässige Unrichtigkeit bzw. den Grenzen nach KLEE (1990) für die maximal erlaubte Gesamtabweichung verglichen. Der Anteil blutgesunder Proben von 552 Patienten betrug 48,6 %. Plasmaveränderungen traten bei 5,8 % aller Blutproben auf. Die Blutanalyse erfolgte im Mittel 1,43 h nach Blutentnahme. Die Carry-Over-Ratio betrug bei 10 Bestimmungen von [K] für den Parameter Erythrozyten (RBC) 0,28 %, für Thrombozyten (PLT) 0,59 %, für Leukozyten (WBC) 0,32 % und für Hämoglobin (HGB) 0,18 %. Die K-Werte lagen für alle 4 Parameter deutlich unter 2%, und somit war die Blutverschleppung ohne Einfluss auf die Gerätepräzision. Die Ergebnisse der Präzisionsmessung in Serie (Variationskoeffizienten siehe Tab. 6.1) und die Präzision der Kontrollblutmessung über die Zeit (n = 105) lagen für den CA530-VET bei allen Tierarten, mit Ausnahme des Parameters PLT bei Kontrollblutmessung niedriger Konzentration (VK = 7,2 %), deutlich innerhalb der von der BÄK (2001) und von KLEE (1990) (siehe Tab. 5.1) geforderten Grenzen. Bei der Präzision der Doppelbestimmung einer Blutprobe lagen die ermittelten Variationskoeffizienten (VK %) ebenfalls deutlich niedriger, als es die Richtlinie der BÄK (2001) und KLEE (1990) erlauben. Ausnahme war der Parameter PLT bei den Tierarten Katze (VK=8,7 %) und Pferd (VK=9,5 %), welcher die maximal zulässige Unpräzision der BÄK von 7 % überschritt. Von den Ergebnissen des Methodenvergleichs sind in Tab. 6.2 für die wichtigsten Parameter die arithmetischen Mittel und die zugehörigen Standardabweichungen der Messdifferenzen aufgeführt. Ausgezeichnete Richtigkeit im Vergleich mit dem CELL-DYN 3500 zeigte der CA530-VET bezüglich der Parameter WBC bei Hund und Pferd sowie RBC beim Pferd. Ausreichend richtige Werte wurden durch den CA530-VET für die Parameter WBC der Katze, RBC bei Hund und Katze sowie HGB und MCV aller Tierarten ermittelt. Die Übereinstimmung der ermittelten Hämatokritwerte mit dem Mikrohämatokritwert war für die Tierart Pferd ausgezeichnet, überschritt für die Katze knapp und für den Hund deutlich die maximal zulässige Unrichtigkeit der BÄK. Bei KLEE (1990) wird für diesen Parameter kein Grenzwert angegeben. Die ermittelten Messabweichungen für RBC und MCV liegen jedoch innerhalb der von KLEE (1990) vorgegebenen maximal erlaubten Abweichungen. Die Bestimmung der Thrombozytenzahl durch den CA530-VET zeigte für alle 3 Tierarten sowohl gemäß der BÄK als auch nach KLEE eine ungenügende Richtigkeit im Vergleich zum CELL-DYN 3500 (Hund) bzw. der manuellen Thrombozytenzählung (Katze, Pferd). Hochgradig thrombozytopenische Proben (< 20 x 103/mm3 PLT) wurden durch das Gerät jedoch bei allen Tierarten gut erkannt. Es ist zu berücksichtigen, dass es sich bei den angewandten Maßstäben um Vorgaben aus der Humanmedizin handelt, die unmodifiziert in die Tiermedizin übernommen wurden. Bezüglich des relativen Differentialblutbildes sind keine offiziellen Grenzen für maximal erlaubte Messabweichungen vorgegeben. Für Lymphozyten und vor allem für die Midcellpopulation waren die prozentualen Messabweichungen jedoch sehr hoch. Die Granulozytenpopulation wurde am besten erkannt. Die während der Studie gesammelten praktischen Erfahrungen mit dem CA530-VET waren positiv. Das Gerät arbeitete schnell (Ergebnisanzeige nach weniger als 1 min), bei regelmäßiger Wartung zuverlässig und verbrauchte nur eine geringe Blutmenge (125 µl). Die Gerätebedienung war einfach und wenig störanfällig. Nachteil war bei geringem Probenumsatz die temperaturabhängig limitierte Reagenzienhaltbarkeit. Insgesamt kann der CA530-VET bei vorsichtigem Umgang mit der ermittelten Thrombozytenzahl als ein zur Zellzählung in der Tiermedizin gut geeignetes Gerät betrachtet werden. Die automatische Differenzierung stellte eine Schwachstelle dieses und aller anderen Geräte seiner Preisklasse dar. Lediglich die Messergebnisse der Granulozytenpopulation können akzeptiert werden. Bei 21 % aller untersuchter Blutproben konnte durch den CA530-VET kein Differentialblutbild ermittelt werden; vorwiegend betroffen war die Tierart Katze. Aktuell ist mit dem Modell CA620-VET eine neue Softwareversion erhältlich, die unter anderem auch für Katzen eine bessere Differenzierung ermöglichen soll. Tab. 6.1: Präzision in Serie (10fach-Bestimmung) des CA530-VET von Hunde-, Katzen- und Pferdeblut, angegeben als Variationskoeffizient VK % Parameter VK % HUND (n = 5x10) VK % KATZE (n = 5x10) VK % PFERD (n = 5x10) RBC (106 /mm3) 1,74 0,98 1,20 HKT (%) 1,81 0,96 1,34 MCV (µm3 ) 0,31 0,43 0,51 MCHC (g/dl) 1,45 4,10 1,39 MCH (pg) 1,38 0,82 1,45 RDW (%) 4,23 1,46 1,74 PLT (103/mm3) 5,27 4,53 5,80 MPV (µm3) 3,06 3,39 2,30 WBC (103/mm3) 1,91 3,51 1,71 HGB (g/dl) 1,24 0,90 1,00 GRAN (%)* 3,71 3,77 5,22 MID (%)* / / 8,43 LYMF (%)* 10,02 19,78 13,50 GRAN abs* 4,95 3,67 5,35 MID abs* / / 11,93 LYMF abs* 8,06 27,13 15,90 * GRAN (%)/abs = neutr. und eos. Granulozyten in %/absolut. MID (%)/abs = Monozyten und baso. Granulozyten in % / absolut. LYMF (%) / abs = Lymphozyten und Blasten in % / absolut. Die Fallzahlen sind für das Differentialblutbild geringer als im Tabellenkopf angegeben, da nicht immer eine Differenzierung durch den CA530-VET möglich war Tab. 6.2: Mittlere Messdifferenzen mit Standardabweichungen zwischen den Ergebnissen der jeweiligen Referenzmethode und dem CA530-VET für die wichtigsten Parameter der Tierarten Hund, Katze und Pferd HUND(n = 210) KATZE(n = 148) PFERD(n = 125) Referenzmethode WBC* (103/mm3) 1,11±1,32 -1,19±3,40 0,51±0,52 CELL-DYN 3500 RBC (106/mm6) 0,34±0,20 0,36±0,41 0,28±0,27 CELL-DYN 3500 HGB (g/dl) 0,54±0,42 0,27±0,46 0,30±0,31 CELL-DYN 3500 HKT (%) 2,00±1,84 1,10±1,61 0,74±1,16 Mikrohämatokrit MCV (µm3) -0,35±1,39 -0,15±1,46 0,16±1,54 CELL-DYN 3500 PLT (103/mm3) 116,44±81,73 88,58±79,89 55,83±46,57 CELL-DYN 3500 (Hd)manuelle Zählung (Ktz/Pfd) GRAN** (%) 2,97±7,45 -0,44±8,16 -4,44±7,24 manuelle Differenzierung MID** (%) -7,33±3,09 -6,83±1,91 -6,84±2,37 manuelle Differenzierung LYM** (%) -2,24±7,44 1,66±8,48 5,98±6,88 manuelle Differenzierung * Für den Parameter WBC sind die Fallzahlen höher als im Tabellenkopf angegeben: n = 241 (Hund), n = 162 (Katze) und n = 143 (Pferd). ** GRAN (Granulozyten), MID (Midcellpopulation) und LYM (Lymphozyten). Die Fallzahlen sind für das Differentialblutbild geringer als im Tabellenkopf angegeben, da nicht immer eine Differenzierung durch den CA530-VET möglich war
Since 1997 the Cell-Analyser Series 530 (CA530, Boule Medical, Stockholm, Sweden) has been used successfully for human medical laboratory diagnostic. The tested instrument, CA530-VET, represents the veterinary edition and has been available on the market since the year 2000. The goal of our study was to examine the operational competence of CA530-VET, model ODEN, for the automatic analysis of canine, feline and equine blood. Carried out under clinical conditions, the study investigated the reliability of the results and evaluated the instrument s general practicability for veterinary use. The fully automated low-end-unit hematology analyser (electronic impedance principle) determines 16 parameters, including the differentiation of three leukocyte populations. Reference instrument for the assessment of the machine s accuracy was the CELL-DYN 3500 (Abbott Laboratories, Illinois, USA) which uses the electronic impedance principle in combination with the measurement of light scattering. For the parameters hematocrit (HCT), the white blood cell differentiation and the platelet count for horses and cats, manual methods such as microcentrifugation, double chamber counting (Thrombo Plus from Sarstedt, Neubauer chamber) and the manual differentiation of 2 blood smears (Pappenheim s stain) each with 100 counted cells, were used as reference. In the Clinic for Small Animals (Klinik und Poliklinik für Kleine Haustiere, Freie Universität Berlin) blood from both healthy and sick dogs (242), cats (166) and horses (144) was examined to check the blood carry-over, precision and accuracy of the instrument. The samples were obtained within the period of one year and each sample was examined within half an hour to four hours after collection. The statistical analysis was carried-out using the statistic program SPSS for Windows version 11.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). The assessment of the results was made based on guidelines for Quality Assurance for Quantitative Laboratory Medical Examinations from the BUNDESÄRZTEKAMMER (BÄK, 2001) and using the performance goals for internal quality control of multichannel hematology analysers established by KLEE (1990). Carry-over of blood cells and hemoglobin was evaluated by measuring control blood in high and low concentration and calculating the carry-over ratio [K %] according to the formula from BROUGHTON et al. (1969). Short-term stability, within each batch, was obtained by running ten replicate analyses of five different blood samples from each animal species. The precision of results obtained from repeated analysis was assessed by comparing duplicate analyses of 550 samples collected for the method comparison study. Control blood (Para 12 Plus, Streck Laboratories, La Vista USA) was used to calculate the long-term stability. Precision was evaluated with measurements taken on each study-workday. An evaluation of CA530-VET s accuracy in comparison with CELL-DYN 3500 and the standard manual methods was made according to the modified model from BLAND and ALTMAN (1986). The individual differences of the results between the two methods were calculated and plotted against the value of the reference method. As a final evaluation, the differences between the tested instrument and the reference method were expressed as percentages and compared with the values for maximal allowable inaccuracy as given in the guidelines from the BÄK and the maximum allowable total bias (mid range) as demanded by KLEE (1990). From the total number of patients (n = 552), 48.6 % gave healthy blood samples with values within our own established reference intervals. 5.8 % of all blood samples showed deviations from normal plasma quality. The average time span between sample collection and blood analysis was 1.43 hours. The carry-over ratio [K %], calculated as the mean of 10 single determinations for K, was 0.28 % for erythrocytes (RBC), 0.59 % for platelets (PLT), 0.32 % for white blood cells (WBC) and 0.18 % for hemoglobin (HGB). Therefore the K-values for all four parameters were smaller than 2 % and consequently had no effect on the instrument s precision. The results of the within-batch precision (coefficients of variation see table 6.1) and the precision of the repeated control blood measurement over time (n = 105) were for the blood of all animal species, except for the parameter PLT when measuring low concentrated control blood (7,2 %), clearly within the demanded limits of both the BÄK and KLEE (see table 5.1) as well. For the duplicate measurements of blood samples the variation coefficients (CV %) were likewise completely within the limits of the BÄK and KLEE. The platelet count for cats (CV 8.7 %) and horses (CV 9.5 %) proved to be the exception, exceeding the BÄK s maximum allowable deviation of 7 % for reliability. The arithmetic mean and standard deviation for the most important parameters from the method comparison study are shown table 6.2. Compared to the CELL-DYN-3500, the CA530-VET showed excellent accuracy for the parameter WBC for dogs and horses and RBC for horses. Sufficiently accurate values were determined by the instrument for the parameter WBC for cats, RBC for dogs and cats as well as HGB and MCV for all three animal species. The accuracy between the obtained HCT values and the microhematocrit results was excellent only for horses. For cats the value exceeded slightly and for dogs quite clearly the BÄK s maximum allowed inaccuracy. KLEE (1990) does not give a limit for HCT in this respect, however the parameters RBC and MCV were lying within the KLEE s (1990) maximum allowable bias. When determinating platelet numbers with the CA530-VET, the results of all tested animal species were unacceptable for both BÄK and KLEE. The CA530-VET showed insufficient accuracy for the dog in comparison to CELL-DYN 3500 and insufficient accuracy for cats and horses in comparison to the manual platelet count. However extremely thrombocytopenic samples with PLT values below 20 x 103/mm3 were detected well for all three animal species. It has to be taken into consideration that the applied standards derive from human medicine and were adopted for veterinary use without any modification. In regards to the relative differential count, there are no existing official limits for the maximum allowable deviation from the reference method. For the lymphocyte and above all the midcell population however the deviation of the measurements in percentage was very high. The best detected cell population was the granulocyte population. The practical experiences with the CA530-VET gained during the study were positive. The analyser worked quickly (results displayed within less than 1 minute), was reliable when serviced regularly and consumed only a small amount of blood (125 µl). The operation of the instrument was simple and had low susceptibility to interferences. One disadvantage however was the temperature- dependent limited durability of the reagents, especially when the daily turnover was low. Altogether the CA530-VET can be considered as a suitable instrument for cell counting in veterinary medicine providing one takes careful consideration on the platelet count. The automatic differential count represents the weak point of this instrument and most others in this price category. Only the results for the granulocyte population can be accepted. For 21 % of all blood samples examined though, the CA530-VET could not give a differential count. Primarily affected were cat samples. Currently a new software version is available with the CA620-VET model which might allow better differentiation in this respect. Tab. 6.1: Coefficients of variation (CV %) for the within-batch precision (10 repeated measurements) of the CA530-VET for canine, feline and equine blood samples Parameters CV % DOG (n = 5x10) CV % CAT (n = 5x10) CV % HORSE (n = 5x10) RBC (106 /mm3) 1.74 0.98 1.20 HCT (%) 1.81 0.96 1.34 MCV (µm3 ) 0.31 0.43 0.51 MCHC (g/dl) 1.45 4.10 1.39 MCH (pg) 1.38 0.82 1.45 RDW (%) 4.23 1.46 1.74 PLT (103/mm3) 5.27 4.53 5.80 MPV (µm3) 3.06 3.39 2.30 WBC (103/mm3) 1.91 3.51 1.71 HGB (g/dl) 1.24 0.90 1.00 GRAN (%)* 3.71 3.77 5.22 MID (%)* / / 8.43 LYMF (%)* 10.02 19.78 13.50 GRAN abs* 4.95 3.67 5.35 MID abs* / / 11.93 LYMF abs* 8.06 27.13 15.90 * GRAN (%) / abs = neutr. and eos. granulocytes in % / absolute. MID (% ) / abs = monocytes and baso. granulocytes in % / absolute. LYMF (%) / abs = lymphocytes and blasts in % / absolute. For the differential count the case numbers were smaller than given in the head of the table as the CA530-VET did not always succeed in differentiation Tab. 6.2: Mean differences and standard deviations between the results of the respective reference methods and the CA530-VET DOG(n = 210) CAT(n = 148) HORSE(n = 125) reference method WBC* (103/mm3) 1.11±1.32 -1.19±3.40 0.51±0.52 CELL-DYN 3500 RBC (106/mm6) 0.34±0.20 0.36±0.41 0.28±0.27 CELL-DYN 3500 HGB (g/dl) 0.54±0.42 0.27±0.46 0.30±0.31 CELL-DYN 3500 HCT (%) 2.00±1.84 1.10±1.61 0.74±1.16 microcentrifugation MCV (µm3) -0.35±1.39 -0.15±1.46 0.16±1.54 CELL-DYN 3500 PLT (103/mm3) 116.44±81.73 88.58±79.89 55.83±46.57 CELL-DYN 3500 (Hd) chamber count (Ktz/Pfd) GRAN (%) 2.97±7.45 -0.44±8.16 -4.44±7.24 blood smear MID (%) -7.33±3.09 -6.83±1.91 -6.84±2.37 blood smear LYM (%) -2.24±7.44 1.66±8.48 5.98±6.88 blood smear * For the Parameter WBC the case numbers are higher than given in the head of the table: n = 241 (dog), n = 162 (cat), n = 143 (horse). ** GRAN (granulocytes), MID (midcellpopulation) and LYM (lymphocytes). For the differential count the case numbers were smaller than given in the head of the table as the CA530-VET did not always succeed in differentiation
