Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gilt als Schlüsselenzym der vaskulären Homöostase. Neben seiner Bedeutung als potenter endogener Vasodilatator ist Stickstoffmonoxid (NO), das Produkt der eNOS, für eine Reihe gefäßprotektiver Eigenschaften verantwortlich. Während für die humane iNOS und nNOS eine Reihe von alternativen Splice-Varianten beschrieben sind, existiert bisher kein Nachweis alternativ gespleißter Isoformen für die eNOS. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten erstmals alternative Splice-Varianten der humanen eNOS nachgewiesen werden. Die drei neuen Splice-Varianten - eNOS13A, eNOS13B und eNOS13C - entsprechen von Exon 1 bis 13 der humanen eNOS. An das Exon 13 schließt sich jeweils ein neues Exon bestehend aus Intron 13 Sequenzen an, gefolgt von einem Poly-A-Schwanz. Im Falle einer Translation der Splice- Varianten entstehen verkürzte eNOS-Proteine, denen große Teile der Reduktase- Domäne fehlen und die keine eigene eNOS-Aktivität besitzen. Die Koexpression von eNOS mit eNOS13A in COS-7 Zellen führte zu einer Abnahme der eNOS- Aktivität durch die Bildung von Heterodimeren. Die Stabilisierung der full- length eNOS-Proteinmenge nach Proteasominhibition deutet auf einen vorzeitigen Abbau der Heterodimere über das Ubiquitin-Proteasom-System hin. Die drei eNOS Splice-Varianten werden nativ in verschiedenen Endothelzellen und in einer Vielzahl humaner Gewebe exprimiert. Eine besonders hohe Expression an eNOS13A- mRNA konnte in humanem Testis-Gewebe nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuartigen potentiellen Mechanismus zur Regulation der eNOS-Aktivität und NO-Produktion über dominant-negative Splice-Varianten der humanen eNOS.
NO, the product of endothelial NOS (eNOS), is a major regulator of vascular homeostasis and a critical factor in preventing cardiovascular diseases. Whereas for human iNOS and nNOS a number of different splice variants have been described, no such splice isoforms are known for eNOS so far. This study describes three novel splice variants for human eNOS. These splice variants - termed eNOS13A, eNOS13B and eNOS13C - share the first 13 exons of human eNOS followed by novel overlapping exons containing intron 13 sequences. All three splice variants share the same polyadenylation signal followed by a poly-A tail. When translated, these splice-variants would result in truncated eNOS proteins lacking eNOS activity. Coexpression of full-length and eNOS13A in COS-7 cells diminished eNOS enzyme activity by formation of heterodimers. Coexpression in COS-7 cells with inhibition of the proteasome suggest an enhanced degradation of the heterodimers by the ubiquitin-proteasome-system. All three splice-variants were expressed in different endothelial cells and various human tissues. Expression of eNOS13A was particularly high in human testis. Taken together, these data suggest a new mechanism for the regulation of eNOS activity and NO production by dominant-negative splice variants of human eNOS.
