The centrosome is the primary microtubule-organizing centre in eukaryotic cells. In addition to its function in microtubule nucleation it is implicated in signalling pathways regulating fundamental processes like cell cycle progression, differentiation or cell stress. Centrosomal aberrations and dysfunction of centrosomal proteins frequently occur in various diseases such as cancer. To better understand these processes on a molecular level, precise functions of single centrosomal components have to be elucidated. Although a series of centrosomal proteins have already been characterised, the knowledge of centrosome composition and of function of its proteins remains incomplete. It was the aim of this project to identify the components of the centrosomal proteome in Drosophila melanogaster and to characterise their function for centrosome integrity, replication and cell cycle regulation. An immunoisolation technique was optimized to obtain highly enriched centrosomal preparations from Drosophila preblastoderm stage embryos for mass spectrometry protein identification. Using this approach, 260 centrosomal candidate proteins were identified and subsequently functionally characterised through RNAi in Drosophila SL2 cells. Analysing the resulting phenotypes by immunofluorescence microscopy and FACS revealed the existence of functional groups of centrosomal proteins playing a role in centrosome integrity, centrosome cycle or cell cycle progression. A new centrosome related function was assigned to 28 proteins. Among these proteins a conserved group of proteins were identified required for maintaining centrosome structure both in Drosophila and in human cells. Furthermore, this work provides evidence for a novel role of the microtubule nucleation proteins, the γ-TuRC proteins, in cell cycle control. A biochemical and functional interaction of γ-TuRC proteins with spindle assembly checkpoint proteins was shown by means of RNAi and immunoprecipitation in Drosophila and tandem-affinity purification in human cells. Depletion of γ-TuRC proteins triggers the spindle assembly checkpoint in addition to activation through lack of kinetochore-microtubule attachment. Simultaneous protein depletion of γ-TuRC and Cnn revealed that the γ-TuRC mediated activation of the spindle assembly checkpoint is independent of centrosome integrity. In summary, a comprehensive proteomic analysis identified novel centrosomal candidate proteins functioning in centrosome integrity, centrosome replication and cell cycle progression. γ-TuRC proteins are implicated in the spindle assembly checkpoint. The interaction of γ-TuRC components with spindle assembly checkpoint proteins is evolutionary conserved between human and Drosophila.
Das Zentrosom ist das Mikrotubuli-organisierende Zentrum in eukaryotischen Zellen. Neben Mikrotubuli-Nukleation spielt es eine Rolle in Signaltransduktionswegen, die fundamentelle zelluläre Prozesse wie das Fortschreiten des Zellzyklus, Differenzierung oder Zellstress regulieren. Zentrosomale Aberration oder Veränderung einzelner zentrosomaler Bestandteile ist häufig in der Entstehung von Krankheiten wie Krebs zu beobachten. Um diese Prozesse auf molekularer Ebene zu verstehen, ist es notwendig, die Funktionen einzelner zentrosomaler Proteine aufzuklären. Obwohl einige zentrosomale Proteine bereits charakterisiert wurden, ist die genaue Zusammensetzung dieses Zellorganells weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die zentrosomalen Proteine in Drosophila melanogaster zu identifizieren und deren Funktion in Integrität und Replikation des Zentrosoms, sowie Regulation des Zellzyklus zu charakterisieren. Ein Immunoisolationsansatz wurde optimiert, um hoch angereicherte zentrosomale Präparationen aus Drosophila Embryonen für die Analyse mittels Massenspektrometrie zu gewinnen. Mit diesem Ansatz wurden 260 zentrosomale Kandidatenproteine identifiziert und anschließend mittels RNAi in Drosophila SL2 Zellen funktionell untersucht. Die Immunfluoreszenzmikroskopie- und FACS-Analyse der resultierenden Phänotypen zeigte, dass sich die Funktion zentrosomaler Proteine in Erhaltung der zentrosomalen Struktur oder Regulation von Zentrosomenzyklus und Zellzyklus in Gruppen einordnen lassen. Eine neue zentrosomale Funktion wurde 28 identifizierten Proteinen zugeordnet. Darunter befand sich eine evolutionär konservierte Protein-Gruppe, die für die Aufrechterhaltung der Zentrosomenstruktur in Drosophila und im Menschen verantwortlich ist. Weiterhin konnte in dieser Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass Proteine des γ-TuRC neben ihrer Funktion in Mikrotubuli- Nukleation eine Rolle im Zellzyklus-Kontrollsystem spielen. Unter Verwendung von RNAi, Immunopräzipitation in Drosophila und Tandem-Affinitäts-Aufreinigung in menschlichen Zellen wurde eine biochemische und funktionelle Interaktion von γ-TuRC-Proteinen mit Spindelcheckpoint-Proteinen festgestellt. Reduzierung von γ-TuRC-Proteinen kann, zusätzlich zur Aktivierung durch fehlende Verbindung zwischen Kinetochor und Spindelmikrotubuli, den Spindelcheckpoint auslösen. Die gleichzeitige Proteinreduktion von γ-TuRC und Cnn belegte, dass γ-TuRC-vermittelte Spindelcheckpointaktivierung unabhängig von der Integrität des Zentrosoms ist. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mit Hilfe einer umfassenden Proteomanalyse neue zentrosomale Kandidatenproteine identifiziert wurden, welchen eine Funktion in Aufrechterhaltung zentrosomaler Integrität, Zentrosomenreplikation und Zellzyklusregulation zugeordnet wurde. An der Aktivierung des Spindelcheckpoints sind γ-TuRC-Proteine beteiligt, deren evolutionär konservierte Interaktion mit Proteinen des Spindelcheckpoints gezeigt wurde.
