Replication and gene expression of plasmids impose a metabolic burden on their host cells. Plasmids have therefore evolved systems to guarantee their own DNA stability and integrity. The stringent regulation of gene expression plays the essential role in the maintenance of plasmids and their hosts. Each step in transcription initiation can be regulated by transcription factors interacting at or near the corresponding promoter, where they either activate or repress the transcription of the gene by interaction with RNA polymerase (RNAP). In eukaryotes, cooperativity between transcription factors is very common to increase activation or repression of a promoter by direct protein-protein interaction or modulation of the local DNA conformation. In prokaryotic transcription regulation only a few examples of cooperativity are found. KorA is a global repressor in the promiscuous IncP-1α plasmid RP4 which regulates cooperatively the expression of plasmid genes whose products are involved in replication, conjugative transfer, and stable inheritance. The seven operator binding sites of KorA (OA1 - OA7) are scattered throughout the RP4 plasmid genome. The aim of this thesis was to determine the high-resolution structure of KorA bound to its operator binding site, and to elucidate important aspects of its molecular mechanisms of gene regulation. The structure of the full- length transcriptional repressor KorA bound to the pseudo-symmetric 18-bp DNA duplex OA* (5’-CBrUBrU GTT TAG CTA AAC ABrUT-3’), that contains the symmetric operator sequence and incorporates 5-bromo-deoxyuridine nucleosides, has been determined by MAD phasing at 1.96-Å resolution. This is the first published crystal structure of the KorA protein. In the crystal structure, KorA is present as a symmetric dimer and contacts DNA via a helix-turn-helix (HTH) motif. Each half-site of the symmetric operator DNA binds one copy of the protein in the major groove. The operator site is smoothly bent and adopts a standard B-DNA conformation. The oligonucleotide shows a two-fold disorder in the crystal structure, however, each specific contact is made to the up and to the down oriented DNA duplex with very similar hydrogen bond lengths. As confirmed by mutagenesis studies, the recognition specificity is based on two KorA side chains, Arg48 and Gln53, forming hydrogen bonds to four bases within each operator half-site. The performed gel-shift assays strongly suggest that the binding mode observed in the crystal reflects the mode of operator recognition by KorA in solution. They identify Gln53 as the crucial residue for specific operator binding. Analytical ultracentrifugation experiments confirmed the stable dimeric appearance of KorA in solution. Further investigation of the binding mode revealed that KorA binds the operator site as a dimer in a 2:1 molar ratio. The strong binding capacity of wt KorA was validated in ITC binding studies with the non-brominated 18mer duplex OA (5’-CTT GTT TAG CTA AAC ATT-3’) containing the class I operator sequence. Combining structural data and binding assays, these results finally explain how KorA recognizes and binds to two classes of operator sites on the RP4 plasmid with different affinities. KorA has a unique dimerization module shared by the RP4 proteins TrbA and KlcB. Considering the high sequence similarity of their C-termini, it was presumed, that the KorA dimerization domain might represent the common fold for all. Cooperativity of the global repressor proteins KorA and TrbA with KorB strongly supported that idea. Highlighting the preserved region on the exposed molecular surface of KorA reveals a large patch of identical and type-conserved amino acids at the top of the dimer region. This conserved surface patch led to the conclusion that these proteins cooperate with the global RP4 repressor KorB in a similar manner via this dimerization module and thus regulate RP4 inheritance.
Replikation und Genexpression von Plasmiden stellen eine metabolische Last für ihre Wirtszellen dar. Infolgedessen haben Plasmide einige Systeme hervorgebracht, die ihre Stabilität und Kopienzahl sichern. Die genaue Regulierung der Genexpression spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung von Plasmiden, sowie ihres Wirts. Jeder Schritt innerhalb der Transkriptionsinitiation kann von Transkriptionsfaktoren am entsprechenden Promoter oder in dessen Umgebung beeinflusst werden. Diese Faktoren aktivieren oder unterdrücken die Transkription durch Interaktion mit der RNA-Polymerase (RNAP). In Eukaryoten ist Kooperativität zwischen Transkriptionsfaktoren ein bekannter Mechanismus, um die Aktivierung oder Unterdrückung des Promoters durch direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen oder durch Ummodellierung der lokalen DNA-Konformation zu erhöhen. Bei Prokaryoten ist Kooperativität in der Transkriptionsregulierung nur selten vorzufinden. KorA ist ein globales Repressorprotein des promiskuitiven IncP-1α Plasmids RP4, welches die Expression von Plasmidgenen, die in Replikation, konjugativem Transfer, und stabiler Vererbung involviert sind, reguliert. KorA bindet an sieben Operatorsequenzen (OA1 OA7), die über das gesamte RP4-Plasmidgenom verteilt sind. Die Zielsetzung dieser Doktorarbeit war es, eine möglichst hochaufgelöste Kristallstruktur von KorA im Komplex mit seiner Operatorbindungsstelle zu erhalten, um den Mechanismus der Genregulation genau zu beleuchten. Die Struktur des Transkriptionsrepressors KorA, gebunden an ein pseudo-symmetrisches 18-bp DNA-Duplex OA* (5’-CBrUBrU GTT TAG CTA AAC ABrUT-3’), welches die symmetrische Operatorsequenz aufweist und 5-Bromodeoxyuridinnukleoside beinhaltet, wurde mittels MAD-Phasierung bei einer Auflösung von 1.96-Å bestimmt. Dies ist die erste publizierte Kristallstruktur des KorA Proteins. Im Kristall ist KorA ein symmetrisches Dimeres, welches die DNA mit einem Helix-Turn-Helix-Motiv kontaktiert. Jede Hälfte der symmetrischen Operator-DNA bindet eine Kopie des Proteins in der großen Furche. Die Operator-DNA ist leicht gebogen und weist die Form von B-DNA auf. Die Oligonukleotide befinden sich in zwei Ausrichtungen im Kristall und überlagern sich in der Struktur. Aufgrund dieser zwei verschiedenen Orientierungen ist jeder spezifische Kontakt zum herauf- und herunterführenden DNA-Duplex ausgebildet, wobei sich die Längen der Wasserstoffbrückenbindungen einander sehr ähnlich sind. Durch Mutagenesestudien konnte die spezifische DNA-Erkennung durch KorA auf zwei Seitenketten von Arg48 und Gln53 eingegrenzt werden. Beide Reste bilden in der Kristallstruktur Wasserstoffbrückenbindungen zu insgesamt vier Basen innerhalb jedes Halb-Operators aus. Die im Anschluss durchgeführten Gel-Retardationsexperimente konnten bestätigen, dass der im Kristall erhaltene Bindungszustand mit dem in Lösung gefundenen übereinstimmt. Gln53 wurde als der entscheidende Rest für die spezifische Operatorbindung ermittelt. Ultrazentrifugationsexperimente bestätigten, dass KorA in Lösung ein sehr stabiles Dimeres ist. Weitere Untersuchungen betreffs des Bindungszustands ergaben, dass KorA DNA im molaren Verhältnis 2:1 bindet. Das hohe Bindungsvermögen von wt KorA wurde anhand von ITC-Bindungsstudien mit dem unbromierten 18-bp Oligonucleotid OA (5’-CTT GTT TAG CTA AAC ATT-3’), welches die Operatorsequenz der Klasse I trägt, bestätigt. Kombiniert man die Daten aus Kristallstrukturanalyse und biochemischen Bindungsstudien, dann verdeutlicht sich, wie KorA die zwei Operatorklassen mit unterschiedlicher Affinität erkennt und bindet. KorA besitzt ein einzigartiges Dimerisierungsmodul, welches auch bei zwei anderen RP4-Proteinen, TrbA und KlcB, zu finden ist. Berücksichtigt man die hohe Sequenzähnlichkeit ihrer C-Termini, kann angenommen werden, dass alle drei Proteine eine ähnliche Struktur der Dimerisierungsdomaine aufweisen. Kooperativität der globalen Repressorproteine KorA und TrbA mit KorB unterstützt diese Hypthese. Verdeutlicht man die konservierten Regionen auf der äußeren Moleküloberfläche von KorA, dann ergibt sich eine ausgedehnte Fläche identischer und ähnlicher Aminosäuren direkt auf dem oberen Teil der Dimerisierungsregion. Diese konservierte Region auf der Dimerisierungsoberfläche lässt die Schlussfolgerung zu, dass KorA, TrbA und KlcB mit dem globalen RP4-Repressorprotein KorB in gleicher Weise über eben dieses Dimerisierungsmodul kooperieren und dadurch die Stabilität des RP4 Plasmids regulieren.
