Plants unlike animals are not able to escape from enemy attack by running away. They evolved a great variety of defense strategies to withstand the manifold attacks of herbivores and pathogens. Conifers in particular have developed effective mechanisms to defend themselves directly and also indirectly by attracting enemies of their enemies. Studies of the tritrophic systems involved in indirect defense have addressed many interesting scientific questions on how plants and insects communicate. An intensively studied indirect defense systems consists of pine (Pinus sylvestris), pine sawflies (Diprion pini) and a hymenopteran egg parasitoid specialized on eggs of sawflies on pine, i.e. Closterocerus ruforum. Egg deposition by the sawfly D. pini is known to induce P. sylvestris to emit higher amounts of the sesquiterpene (E)-β-farnesene on the third day after oviposition which attracts the egg parasitoid. This parasitoid lays its eggs in the D. pini eggs and the hatching parasitoid larva is killing the developing sawfly embryo inside the sawfly egg. Volatiles attractive to the egg parasitoid are emitted both from the site of egg deposition and adjacent tissue. Olfactometer tests showed that (E)-β-farnesene alone does not attract the parasitoid, but other volatile cues are also necessary for the parasitoid to respond. These other volatiles are the monoterpenes β-phellandrene and β-ocimene and the sesquiterpenes (E)-β-caryophyllene and α-humulene. Further it is known that C. ruforum does not only accept D. pini as host, but also the closely related sawfly species Gilpinia pallida and Neodiprion sertifer. While egg deposition by N. sertifer on P. sylvestris also induces volatiles that attract the egg parasitoid, egg deposition by G. pallida does not. Based on this knowledge, the PhD study presented here investigated the molecular response of P. sylvestris to sawfly oviposition to gain new insight into the mechanisms of egg parasitoid attraction. Emphasis was placed on the identification and expression of genes encoding the terpene synthase enzymes that produce sesquiterpenes involved in attraction of the egg parasitoid. 1\. Isolation and functional characterization of pine terpene synthases with potential involvement in egg parasitoid attraction In order to investigate whether sawfly egg deposition activates genes encoding pine sesquiterpene synthases, a range of candidate genes was isolated and functionally described. The main goal was to identify an (E)-β-farnesene synthase gene since this volatile was shown to be the principal attractant of the egg parasitoid. First, mRNA was extracted from oviposition-induced P. sylvestris needle tissue and used for cDNA synthesis. Using cDNA as template along with sesquiterpene specific degenerate primers in PCR approaches, fragments of candidate genes were isolated. The fragments were then elongated to full coding sequences by means of RACE technology. Three new sesquiterpene synthases, named PsTPS1, PsTPS2 and PsTPS3, were isolated. In a parallel approach using the same cDNA and a known sequence of a (E)-β-farnesene synthase from Douglas fir as template information, the fourth sesquiterpene synthase was isolated and named PsTPS5. To functionally characterize the enzymes, heterologous expression was carried out in Escherichia coli which revealed the principal products as (E)-β-caryophyllene and α-humulene (PsTPS1), 1(10),5-germacradiene-4-ol (PsTPS2), longifolene and α-longipinene (PsTPS3) and (E)-β-farnesene (PsTPS5) (Chapter 2 & 3). 2\. Measurement of terpene synthase transcript levels over a time course after sawfly egg deposition in comparison with parasitoid attraction bioassays P. sylvestris is known to respond to eggs laid by the sawfly D. pini by releasing an attractive blend of terpenoids, with sesquiterpenes playing an important role in this process. We analysed the transcription levels of the isolated sesquiterpene synthase genes in needles oviposited upon by D. pini in comparison to artificially wounded needles (odor of artificially wounded, egg-free needles is not attractive to parasitoids; the artificial wounding mimicked the ovipositional wounding). We found that egg deposition enhances the transcription of the sesquiterpene synthases PsTPS1 ((E)-β-caryophyllene/α-humulene synthase) and PsTPS2 (1(10),5-germacradiene-4-ol synthase) in needle material that is attractive to the parasitoids (day 3 after oviposition). Transcript levels of PsTPS3 (longifolene synthase) did not change in response to egg deposition at all. The expression level of PsTPS5, which produces (E)-β-farnesene - the compound previously determined to be responsible for attraction of the egg parasitoid C. ruforum, was reduced in oviposition-induced needles. This result suggests that the enhanced emission of (E)-β-farnesene found in attractive, oviposition-induced pine needles is not regulated by transcriptional changes of the detected (E)-β-farnesene synthase. Alternatively, a further (E)-β-farnesene synthase than the one detected here may produce the enhanced quantities of (E)-β-farnesene in response to egg deposition. In contrast to PsTPS5, transcripts of PsTPS1 and PsTPS2 were highest when the pine odor was attractive for the egg parasitoid. Since we did not observe any change in emission rate or accumulation of PsTPS1 and PsTPS2 products at this time, this could imply that production of these compounds is not determined by gene expression of PsTPS1 and PsTPS2 (Chapter 2 & 3). 3\. Measurement of terpene synthase transcript levels after egg deposition by other sawfly-host plant combinations To gain a better understanding of the species specificity of transcriptional changes of sesquiterpene synthases after sawfly egg deposition on pine and of its dependence on time after egg deposition, we compared effects of D. pini oviposition on P. sylvestris with those induced by other sawfly species: N. sertifer eggs on P. sylvestris, G. pallida eggs on P. sylvestris. Furthermore, we determined transcription of sesquiterpene synthases of P. nigra after egg deposition by D. pini. The herbivore-host plant combination N. sertifer / P. sylvestris showed a similar attraction pattern as that previously described for D. pini eggs on P. sylvestris, but the other two combinations (G. pallida / P. sylvestris and D. pini / P. nigra) did not lead to an induction of attractive volatiles at any of the three tested time points (tested 1, 2 and 3 d after egg deposition). As determined by quantitative real-time PCR, both PsTPS1 and PsTPS2 transcript levels, increased significantly after oviposition by N. sertifer on P. sylvestris, again only after the time point (3 days after induction) where the needle odor was attractive for the parasitoid. Expression levels of PsTPS5 were not elevated in any tissue attractive for the parasitoid. Thus, the PsTPS1 and PsTPS2 genes are good markers for parasitoid attraction. Hence, our results demonstrate a specific transcriptional response to egg deposition, distinct from that caused by artificial wounding. No elevated transcript levels were detected for sesquiterpene synthases in plant material that was unattractive for the egg parasitoid. Furthermore, these experiments showed that transcriptional changes of PsTPS1 and PsTPS2 depend on the sawfly species and the time after egg deposition. (Chapter 3) 4\. Does sawfly oviposition prepare a defensive response directed at the feeding larvae? Both oviposition and feeding by herbivorous insects are well-known to induce plant defense. In this study, we investigated if prior egg deposition affected plant defense against feeding larvae using the P. sylvestris - D. pini system. Laboratory bioassays showed that performance of sawflies which began feeding on those pine needles where they had hatched was worse than on needles that had never had eggs. Survival rates of larvae feeding on previously egg leaden needles were significantly lower compared to survival of larvae on egg-free needles. We also could detect transgenerational effects of egg deposition on sawfly performance. Female sawflies that spent their larval development on needles with eggs were less fertile than those that developed on egg free needles. The transcription of the two sesquiterpene synthases (PsTPS1 and PsTPS2) that we had shown to be good marker genes for D. pini oviposition was clearly enhanced in needles that had had eggs as compared to those on which larvae were feeding without prior egg laying. However, the accumulation of secondary metabolites known to negatively influence larval performance did not show a similar trend. Neither terpenes (mono-, sesqui-, and diterpenes) nor phenolic compound concentrations were higher in the needles with prior oviposition. Nitrogen and water contents in feeding damaged needles with and without eggs did not differ. Nevertheless, based on the performance studies we can conclude that previous oviposition prepares the plant for defense against upcoming larval feeding although the mechanism is still unclear (Chapter 4). 5\. Review: PsTPS1, PsTPS2, PsTPS3 and PsTPS5: Products / Function in plant-insect interaction In this review we highlight the biosynthesis of terpenes, their regulation within a plant and their role in plant-insect communication. Special emphasis is given to products synthesized by the sesquiterpene synthases PsTPS1, PsTPS2, PsTPS3 and PsTPS5 identified in this PhD study. Furthermore, we compare the characteristics of the sesquiterpenes synthases identified here with those known from other sesquiterpene synthases. We also address the kinetics of expression of the sesquiterpene synthase genes in response to herbivore attack.
Pflanzen sind im Gegensatz zu Tieren nicht in der Lage, bei drohenden Gefahren von Fraßfeinden die Flucht zu ergreifen. Sie entwickelten mannigfaltige Abwehrstrategien um sich gegen Angreifer wie Herbivoren und Pathogene zu wehren. Insbesondere Koniferen mussten auf Grund ihrer langen Lebensdauer schon sehr früh wirksame Mechanismen entwickelen, um sich auf direkte als auch indirekte Art, was die Anlockung von Feinden ihrer Feinde beinhaltet, zu verteidigen. Studien zu diesen tritrophischen Systemen haben viele wissenschaftlich interessante Fragen wie z.B. zur Kommunikation zwischen Pflanzen und Insekten aufgeworfen. Eines der umfangreich erforschten indirekten Abwehrsysteme behandelt die Interaktion zwischen der Kiefer (Pinus sylvestris), der Kieferblattwespe (Diprion pini) und dem Eiparasitoiden Closterocerus ruforum, der sich auf die Eier der Blattwespen auf der Kiefer, die auf den Kiefernnadeln abgelegt werden, spezialisiert hat. Es ist bekannt, dass die Eiablage der herbivoren Pflanzenwespe D. pini an der Wirtspflanze P. sylvestris eine erhöhte Abgabe des Sesquiterpenes (E)-β-Farnesen drei Tage nach der Eibablage induziert, was wiederum den Parasitoiden C. ruforum anlockt. Dieser Parasitoid legt seine Eier in die D. pini Eier, wobei dessen parasitoiden Larven die sich entwickelnden Blattwespenembryonen töten. Die für den Parasitoiden attraktiven Duftstoffe werden nicht nur direkt von den eierbelegten sondern auch systemisch von den angrenzenden eifreien Nadeln abgegeben, was so zur Verstärkung des Signals führt. Kürzlich gewonnene Erkenntnisse aus olfaktorischen Tests zum Verhalten des Parasitoiden zeigen, dass (E)-β-Farnesen nicht nur allein attraktiv auf den Parasitoiden wirkt und dass noch andere volatile Hinweise zur Anlockung benötigt werden. Als diese anderen volatilen Komponenten wurden beispielsweise die Monoterpene β-Phellandren and β-Ocimen sowie die Sesquiterpene β-Caryophyllen und α-Humulen identifiziert. Studien zum Verhalten des Eiparasitoiden zeigten weiterhin, dass C. ruforum neben D. pini auch andere Blattwespenarten, wie z.B. Gilpinia pallida oder Neodiprion sertifer als Wirt akzeptiert. Hierbei induziert nur die Eiablage von N. sertifer die Abgabe von für den Parasitoiden attraktiven Duftstoffen, wohingegen die Eiablage von G. pallida nicht diesen Effekt mit sich bringt. Um erstmalig Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Anlockung des Parasitoiden zu gewinnen, beschäftigt sich die hier vorgestellte Arbeit mit den molekularbiolgischen Grundlagen der Antwort des Baumes auf die Eiablage von Blattwespen. Eine besondere Gewichtung erfuhr hierbei die Identifizierung und Expression von Terpensynthase codierender Gene, die nach der Eiablage der Blattwespen Sesquiterpene synthetisieren, die dann wiederum anlockend für den Parasitoiden sind. 1\. Isolation und funktionale Charakterisierung von Terpensynthasen aus der Kiefer (P. sylvestris) die vermutlich in die Anlockung des Eiparasitoiden involviert sind. Um zu klären, ob die Eiablage von Blattwespen die Transkription von Pinus-Terpensynthasen induziert, wurde eine Reihe von Genkandidaten isoliert und funktional charakterisiert. Hierbei war das Hauptziel, das Gen zu identifizieren, das für die (E)-β-Farnesen Synthase codiert, da diese volatile Substanz hauptsächlich attraktiv auf den Parasitoiden wirkt. Hierzu wurde zuerst die mRNA aus Eiablage-induziertem Pflanzenmaterial isoliert und anschliessend in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde darauffolgend zusammen mit degenerierten Primern, die spezifisch für Sequenzen von Sesquiterpensynthasen sind, in PCR Versuchen verwandt, um Fragmente putativer Sesquiterpensynthase kodierender Gene zu amplifizieren. Die komplette Identifizierung der kodierenden cDNA erfolgte daraufhin durch Amplifikation der cDNA-Bereiche mithilfe 5’- und zusätzlicher 3’-RACE-PCR Technologie. Mittels dieser Methode konnten 3 Sesquiterpensynthasen identifiziert werden, die mit PsTPS1, PsTPS2 und PsTPS3 bezeichnet wurden. In einem parallelen Ansatz wurde unter Benutzung der gleichen cDNA und anhand der Sequenz der nahezu homologen (E)-β-Farnesen Synthase aus der Douglasie (Pseudotsuga menzii), der kodierende Bereich einer weiteren Sesquiterpensynthasen der PsTPS5 mittels PCR aus der Kiefer isoliert. Um die Funktion der Enzyme zu beschreiben, wurden diese dann heterolog in Escherichia coli exprimiert. Folgende Hauptprodukte konnten daraufhin identifiziert werden: (E)-β-Caryophyllen und α-Humulen (PsTPS1), 1(10),5-Germacradien-4-ol (PsTPS2), Longifolen und α-Longipinen (PsTPS3) und (E)-β-Farnesen (PsTPS5) (Chapter 2 & 3). 2\. Trankriptmengen nach Eiablage von D. pini an P. sylvestris nach verschiedenen Zeitpunkten im Vergleich zur Attraktivität für Parasitoiden Die Ablage von Eiern der Blattwespe D. pini an P. sylvestris verändert das pflanzliche terpenoide Duftmuster so, dass parasitische Wespen angelockt werden. Dabei spielen Sesquiterpene eine ausschlaggebende Rolle. Wir analysierten die Menge der Transkripte der isolierten Sesquiterpensynthase Gene in D. pini Eiablage-induzierten Nadeln im Vergleich mit artifiziell verwundeten Nadeln, deren Duft von artifiziell verwundeten, Ei-freien Nadeln ist für den Parasitioiden nicht attraktiv ist. Es konnte 3 Tage nach Eiablage eine transkriptionelle Aktivierung der Sesquiterpensynthase Gene PsTPS1 ((E)-β-Caryophyllen/α-Humulen Synthase) und PsTPS2 (1(10),5-Germacradien-4-ol Synthase) in den für den Eiparasitoiden attraktiven Nadel festgestellt werden. Analysen der PsTPS3 Transkriptmenge (Longifolen Synthase) ergaben dahingegen zu keinem gemessenen Zeitpunkt nach Eiablage durch D. pini signifikant erhöhte Werte. Die PsTPS5, die das für die Anlockung des Parsitoiden auschlaggebende Sesquiterpen (E)-β-Farnesen produziert, zeigt wider Erwarten eine Reduktion der Transkripte in eiinduzierten Nadeln. Dies könnte bedeuten, dass die erhöhte Synthese von (E)-β-Farnesen in den für den Parasitoiden attraktiven, Eiablage-induzierten Nadeln nicht durch die transkriptionelle Regulierung der PsTPS5 bestimmt wird. Eine weitere Möglichkeit der Erklärung wäre, dass eine andere (E)-β-Farnesen Synthase für die erhöhte (E)-β-Farnesen Abgabe nach Eiablage verantwortlich ist. Im Gegensatz zur PsTPS5, reagieren PsTPS1 und PsTPS2 auf D. pini Eiablage mit einer erhöhten Expression, die ausschließlich zu dem Zeitpunkt, an dem der Nadelduft attraktiv für den Parasitoiden ist, gemessen wurde. Widersprüchlicherweise und bisher ungeklärt ist die Tatsache, dass wir zu den erhöhten Transkriptmengen von PsTPS1 und PsTPS2, weder eine erhöhte Abgabe in die Atmosphäre zuordnen, noch eine erhöhte Akkumulation an Produkten in der Nadel zuordnen konnten. Dies könnte ein Indiz dafür sein, dass die Synthese dieser Produkte nicht auf der Ebene der Genexpression reguliert wird (Chapter 2 & 3). 3\. Transkriptmengen nach Eiablage anderer Blattwespen-Wirtspflanze Kombinationen im Vergleich zur Attraktivität für Parasitoiden Um ein besseres Verständnis über die Artenspezifität der trankriptionellen Regulierung der Sesquiterpenesynthasen nach Blattwespen- Eiablage an der Kiefer und deren Abhängigkeit von der Induktionszeit nach Eiablage zu erlangen, wurde der Einfluss von D. pini Eiablage an P. sylvestris mit den Effekten einer Eiablage durch andere Blattwespenarten verglichen: Neodiprion sertifer an Pinus sylvestris, Gilpinia pallida an Pinus sylvestris. Desweiteren wurde geprüft, wie sich die Eiablage von D. pini an P. nigra auf die Transkription der Sesquiterpenesynthasen auswirkt. Die Blattwespen- Wirtspflanze Kombinationen N. sertifer an P. sylvestris zeigte eine Induktion eines für den Eiparasitoiden C. ruforum attraktiven Duftmusters, während bei den beiden anderen Kombinationen (G. pallida / P. sylvestris and D. pini / P. nigra) kein attraktives Duftmuster zu den drei gemessenen Zeitpunkten 1, 2 und 3 Tage nach Eiablage gemessen werde konnte. Quantitative PCR Analysen haben gezeigt, dass die Transkriptmengen der Terpensynthasen PsTPS1 und PsTPS2 nach N. sertifer Eiablage an P. sylvestris ebenfalls nur zu dem einen Zeitpunkt (nach 3 Tagen), an dem der abgegebene Duft der Nadeln attraktiv für den Parasitoiden ist, signifikant erhöht sind. Hingegen war die Expression von PsTPS5 in keinem für den Parasitoiden attraktiven Pflanzenmaterial erhöht. Daraus schlussfolgernd könnte man PsTPS1 und PsTPS2 als Markergene für die Parasitoiden Anlockung bezeichnen, deren Expression mit der Attraktivität des tritrophischen Systems korreliert. Unsere Ergebnisse zeigen demzufolge eine spezifische transkriptionelle Antwort nach Eiablage. Weiterhin konnte keine transkriptionelle Aktivierung der Sesquiterpensynthasen in den für den Eiparasitoiden unattraktivem Pflanzenmaterial gefunden werden. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse das die transkriptionelle Regulierung von PsTPS1 und PsTPS2 von der Blattwespenart und der Dauer der Eiablage-Induktion abhängig ist (Chapter 3). 4\. Erfolgt nach Eiablage eine Reaktion des Baumes, die sich gegen die später schlüpfenden, dann fressenden Larven richtet? Die pflanzliche Abwehr kann durch herbivoren Fraß oder herbivore Eiablage induziert werden. Im Falle der Blattwespen, findet zuerst eine Eiablage gefolgt vom anschließenden Fraß statt. In dieser Studie untersuchten wir, ob die herbivore Eiablage die pflanzliche Abwehr gegen später fressende Larven unter Nutzung des bekannten P. sylvestris - D. pini Systems beeinflusst. Unsere Untersuchungen zeigten eine eindeutig schlechtere Larvenentwicklung, wenn sich Larven auf Eiablage- induzierten Nadeln anstelle von auf nichtinduzierten Nadeln entwickelt haben. Die Überlebensrate von Larven, die eiinduzierte Nadeln fraßen, war signifikant kleiner als im Vergleich zu der von Larven, die nichtinduzierte Nadeln zur Verfügung hatten. Wir konnten desweiteren transgenerationale Effekte, verursacht durch die Eiablage der Blattwespen, auf die Larvenentwicklung feststellen. Weibchen deren Larvenentwicklung auf Nadeln mit Eiern erfolgte, waren weniger fruchtbar als die Weibchen die sich auf eifreien Nadeln entwickelten. Molekulare Untersuchungen zu den von uns identifizierten Sesquiterpensynthasen (PsTPS1und PsTPS2) ergaben signifikant erhöhte Transkriptmengen in Eiablage-induzierten Nadeln, während in Nadeln, die nur durch Fraß induziert wurden, ohne das eine Eiablage vorher stattfand, diese nicht gemessen wurde. Die Untersuchungen zur Akkumulation sekundärer Metaboliten als mögliche Abwehrreaktion der Pflanze, ergaben allerdings weder für den Gehalt an Mono-, Di-, und als auch Sesquiterpenen noch nach der Analyse phenolischer Verbindungen Unterschiede. Ebenso konnten keine Veränderungen in der Stickstoff- und Wasserverfügbarkeit zwischen Fraß beschädigten und eiinduzierten Nadeln gefunden werden. Trotzdem müssen wir basierend auf den Daten der Larvenperformanz davon ausgehen, dass die vorherige Eiablage von D. pini die Pflanze auf den bevorstehenden Fraß vorbereitet obzwar die genauen zugrunde liegenden Mechanismen vorerst weiter ungeklärt sind (Chapter 4). 5\. Review: PsTPS1, PsTPS2, PsTPS3 und PsTPS5 Produkte / Funktion in Pflanzen-Insekten Interaktion In diesem Review wird unter spezieller Berücksichtigung der Produkte der Sesquiterpensynthasen PsTPS1, PsTPS2, PsTPS3 und PsTPS5, die im Zuge dieser Arbeit identifiziert wurden, insbesondere auf die Biosynthese der Terpene, ihrer Regulation innerhalb der Pflanze und ihrer spezifische Rolle in der Pflanzen-Insekten Kommunikation eingegangen. Weiterhin vergleichen wir die Eigenschaften dieser Sesquiterpensynthasen mit denen anderer bereits bekannter Sesquiterpensynthasen. Ferner gehen wir hier auf die Induzierbarkeit sowie die Expressionskinetik der Sesquiterpensynthase codierenden Gene als Antwort auf den Angriff von Herbivoren ein
