Prostate tumourigenesis is accompanied by extensive alterations in the DNA methylation patterns with presumably severe effects on gene expression. To identify tumour- and tumour subgroup- specific alterations in the DNA methylation pattern I applied an immunoprecipitation-based enrichment approach for methylated DNA regions followed by SOLiD sequencing (MeDIP-Seq) on 51 tumour and 53 normal prostate samples. I discovered significant hypermethylations in homeobox genes, tumour suppressor and oncogenes, G protein coupled receptors, as well as in microRNA regions; hypomethylations mainly occurred in repetitive extragenic regions. Beside regions that are already described as hypermethylated in prostate cancer like GSTP1 and RARB I extracted hundreds of promising tumour specific markers and could validate more than 80 of them using bisulphite mass spectrometry analyses. Furthermore, I could show the diagnostic potential of three of the markers for the non- invasive detection of prostate cancer in urinary DNA by a quantitative methylation specific PCR approach. Integration of gene and miRNA expression data with the methylation data revealed a dependency of gene expression from DNA methylation mainly in highly expressed genes. Using luciferase methylation assays I could prove methylation dependent downregulation of DUOX1, miR23/24/27 and miR26a. Approximately 50% of all prostate tumours show a fusion of the androgen regulated transmembrane protease, serine 2 (TMPRSS2) and the v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog (ERG) oncogene resulting in an increased expression of ERG. Comparisons of the DNA methylation patterns of TMPRSS2:ERG fusion positive and fusion negative tumours revealed pronounced differential methylations in the latter (‘methylator’ phenotype) while fusion positive samples exhibited a less altered methylation phenotype. In further analyses, I could show that enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) – a histone methyltransferase linking histone modifications to DNA methylations – was significantly higher expressed in fusion negative samples. This went along with a hypermethylation of the miR26a genomic region leading to a decreased expression of the EZH2 regulating miR26a. Treatment of fusion negative PC3 cells with 5-aza-2’-deoxycytidine could re-establish miR26a expression with subsequent EZH2 suppression. Based on these data, I deduced a model for the development of prostate cancer in fusion positive and fusion negative patients: In tumours bearing the TMPRSS2:ERG fusion gene the increased expression of ERG results in a direct activation of the transcription of EZH2 and further oncogenes, while in fusion negative tumours the genomic methylation and suppression of miR26a causes an even more pronounced upregulation of EZH2. This strong increase of EZH2 leads to extensive changes in the DNA methylation and gene expression patterns. The elucidated pathways can be exploited in personalised prostate cancer therapies: Based on the pathomechanism of fusion positive tumours PARP1 inhibitors could be used in this class, while patients without a TMPRSS2:ERG gene fusion might benefit from EZH2 inhibitors like 3-deazaneplanocin A.
Die Entstehung von Prostatatumoren wird von weitreichenden Veränderungen der DNA-Methylierungs- und assoziierter Genexpressionsmuster begleitet. Zur Identifizierung tumor- und tumorsubklassenspezifischer Variationen der DNA- Methylierungsmuster habe ich methylierte DNA-Regionen von 53 Normal- und 51 Tumorproben über Immunopräzipitationen angereichert und mit dem SOLiD-System sequenziert (MeDIP-Seq). Dabei konnte ich signifikante Hypermethylierungen in Homöobox-, Tumorsuppressor- und Onkogenen, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, sowie in microRNA-Regionen feststellen. Hypomethylierungen betrafen hingegen vor allem repetitive extragenische Bereiche. Neben den in Prostatatumoren bereits als hypermethyliert beschriebenen Regionen wie GSTP1 oder RARB habe ich hunderte weitere tumorspezifische Marker identifiziert und konnte mehr als 80 von ihnen unter Verwendung eines bisulfitspezifischen Massenspektrometrieansatzes validieren. Für drei Marker habe ich in DNA, die ich aus Patientenurin isoliert habe, quantitative methylierungsspezifische PCRs durchgeführt und konnte so das Potential dieses nichtinvasiven Ansatzes für die Prostatakrebsdiagnose aufzeigen. Die Integration von Gen- und microRNA-Expressionsdaten mit den Methylierungsdaten zeigte eine Abhängigkeit der Genexpression von DNA-Methylierungen insbesondere bei stark exprimierten Genen auf. Durch Luziferase-Methylierungsexperimente konnte ich eine methylierungsabhängige Herabregulierung der Expressionen von DUOX1, miR23/24/27 und miR26a bestätigen. Bei etwa 50% aller Prostatatumore läßt sich eine Fusion der androgenregulierten transmembrane protease, serine 2 (TMPRSS2) und dem Onkogen v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog (ERG) nachweisen, die eine vermehrte Expression von ERG zur Folge hat. Vergleiche der Methylierungsmuster der TMPRSS2:ERG-fusionspositiven und -negativen Tumore zeigten eine deutlich ausgeprägtere differentielle Methylierung in letzteren („Methylator“-Phänotyp), während fusionspositive Tumore einen weniger stark veränderten Methylierungsphänotyp aufwiesen. In weiterführenden Analysen konnte ich zeigen, daß enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) – eine Histonmethyltransferase und Bindeglied zwischen Histonmodifikationen und DNA- Methylierung –in fusionsnegativen Proben signifikant stärker exprimiert vorliegt. Dies wird von einer genomischen Hypermethylierung der miR26a-Region begleitet, die zu einer verminderten Expression der EZH2-regulatorischen miR26a führt. Eine 5-Aza-2`-desoxycytidin-Behandlung fusionsnegativer PC3-Zellen führte zur Wiederherstellung der miR26a-Expression und damit zu einer Suppression von EZH2. Basierend auf diesen Daten konnte ich ein Modell der Entstehung von fusionsnegativen und –positiven Tumoren ableiten: Bei Tumoren mit dem TMPRSS2:ERG-Fusionsgen führt die Überexpression des ERG- Onkogens zu einer direkten Aktivierung der Transkription von EZH2 und weiteren Onkogenen. Bei fusionsnegativen Tumoren hingegen führt die genomische Methylierung der miR26a Region und die damiteinhergehende verminderte Expression von miR26a zu einer noch stärker ausgeprägten Überexpression von EZH2. Dieser sehr starke Anstieg von EZH2 führt zu extensiven Veränderungen der DNA-Methylierungs- und Genexpressionsmuster in dieser Tumorsubgruppe. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Mechanismen haben weitreichende Konsequenzen für eine personalisierte Therapie von Patienten mit Prostatatumoren: Aufgrund des Pathomechanismus bieten sich bei fusionsgenpositiven Tumoren PARP1-Inhibitoren an, wohingegen Patienten ohne TMPRSS2:ERG-Genfusion von EZH2-Inhibitoren wie 3-deazaneplanocin A profitieren würden.