Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl photochemische als auch antiinfektive sowie immunmodulierende Eigenschaften des Spezialextraktes EPs® 7630 untersucht. Zu Vergleichszwecken wurden parallel selbsthergestellte Fraktionen, Reinsubstanzen sowie bereits im Arbeitskreis vorhandene definierte Proanthocyanidinextrakte mitgeführt. Auf diese Weise war es möglich Struktur- Wirkungsbeziehungen abzuleiten. Phytochemische Ergebnisse: Mit Hilfe von präparativen Trennverfahren, wie der Säulenchromatografie oder der präparativen HPLC, konnten Umckalin, 6,8-Dihydroxy-5,7-dimethoxycumarin, 5-Hydroxy-6,7-dimethoxycumarin-8-sulfat, Catechin/ Epicatechin, Gallocatechin/ Epigallocatechin, Gallocatechin-4α,8-epigallocatechin, Epicatechin- 4β,8-epigallocatechin, Gallocatechin-4α,6-gallocatechin sowie Epigallocatechin-4β,8-epicatechin isoliert und mittels spektroskopischen Methoden (MS, NMR) strukturell aufgeklärt werden.Im Focus der Arbeit standen die Proanthocyanidine. Neben der erstmaligen detaillierten Strukturaufklärung von Dimeren aus EPs® 7630, mit Epigallocatechin-4β,8-epicatechin als neuen Naturstoff, konnten massenspektroskopisch oligomere Verbindungen mit bis zu sechs Untereinheiten nachgewiesen werden, die vorwiegend als Prodelphinidine anzusehen sind. Als Reaktionsprodukt nach Säurehydrolyse wurde das pentahydroxylierte Delphinidin, in Einklang mit den Daten aus den Massenspektren, identifiziert. Die spektroskopischen und chemischen Untersuchungen der Proanthocyanidine wurden durch die Bestimmung des Gerbstoffanteils nach der Methode Europäischen Arzneibuch im Extrakt abgerundet (Polyphenolgehalt von ca. 22%). Ergänzend zu der bekannten Vielzahl an Cumarinen war das Auffinden weiterer ungewöhnlicher Cumarine ein zusätzlicher phytochemischer Aspekt. In diesem Zusammenhang konnte das einzigartige Vorkommen sulfatierter Vertreter erneut belegt und mit 5-Hydroxy-6,7-dimethoxycumarin-8-sulfat und einem Monohydroxy-monomethoxy- cumarinsulfat in einer Mischung Hinweise auf neue Verbindungen in EPs® 7630 erhalten werden. EPs® 7630 bzw. die darin enthaltenen Proanthocyanidine verminderten das Adhäsionsvermögen von A-Streptokokken um bis zu 47% (bei einer Inkubationskonzentration von 30 µg/ml). Dabei war die Trihydroxilierung des B-Ringes der Flavan-3-ol Untereinheiten von entscheidender Bedeutung für die Aktivität, während der Polymerisierungsgrad eine untergeordnete Rolle spielte. EPs® 7630 zeigte eine bemerkenswert hohe inhibitorische Aktivität gegenüber der Neuraminidase (IC50 ca. 1 µg/ml). Die kommerziell erhältlichen Arzneistoffe Zanamivir (IC50 ca. 18 µg/ml) und Oseltamivircarboxylat (IC50 ca. 54 µg/ml) waren deutlich schwächer aktiv in dem verwendeten in vitro Modell. Das Enzym wurde insbesondere von Proanthocyanidinen gehemmt, die eine Mindestkettenlänge von drei Untereinheiten haben. Ps® 7630 zeigte ausgeprägte immunstimulierende Eigenschaften auf Makrophagen. Durch Inkubation von leishmanieninfizierten Makrophagen mit EPs® 7630 wurde die Erregerlast auf 52% verringert. Die biozide Wirkung korrelierte gut mit der induzierten Bildung von •NO-Radikalen und beruhte somit nicht auf einer direkten toxischen Wirkung gegen Leishmanien, sondern auf der Aktivierung von zytotoxischen Abwehrmechanismen. Makrophagen wurden nach Inkubation mit EPs® 7630 auch zur Sekretion von Zytokinen angeregt. Zwar konnte lediglich TNF-α mittels ELISA im Überstand nachgewiesen werden, nicht jedoch IL-12 und IFN-γ. Die mit EPs® 7630 behandelten nicht infizierten (332 pg/ml) als auch infizierten (432 pg/ml) Makrophagen produzierten im Vergleich zur Positivkontrolle (IFN-γ plus LPS; 225 pg/ml (nicht infizierte Zellen), 462 pg/ml (infizierte Zellen)) hohe Titer TNF-α. Des Weiteren wurde durch die Behandlung EMCV-infizierter IFN-sensitiver L929-Fibroblasten mit den Überständen ein starker Virusschutz in den Zellen induziert. Die Wirkstärke entsprach der von ca. 24 U/ml eines IFN-γ Standards. Diese Hemmung des zytopathischen Effektes wird mit einer Interferonbildung assoziiert, welche unterhalb der Detektionsgrenze liegen musste. Ergänzend zu bereits vorhandenen Arbeiten zum antioxidativen Potential, wurde EPs® 7630 als Fänger von •NO-Radikalen in einem zellfreien Assay mit SNP als •NO-Donor getestet. Der Extrakt zeigte ein Scavengingpotential mit einem IC50-Wert von ca. 160 µg/ml (Quercetin IC50 ca. 110 µg/ml), das auf den Gehalt von Polyphenolen sowie oligomeren Proanthocyanidinen zurückzuführen ist. Zum einen erwiesen sich polyphenolfreie Extrakte als inaktiv, zum anderen zeigte der Vergleich mit Proanthocyanidinen, dass das Hydroxylierungsmuster am Ring B der Flavan-3-ol Grundbausteinen ein wesentliches Strukturmerkmal darstellte: Prodelphinidine besaßen ein höheres •NO-Radikalfängerpotential als Procyanidine.
In the present thesis phytochemical, anti-infective as well as immunomodulatory properties of the special extract EPs® 7630 were examined. For comparison purposes, self-made fractions, pure substances and defined proanthocyanidin extracts from the working group were tested in parallel. In this way it was possible to derive structure-activity relationships. Using preparative separation techniques such as column chromatography or preparative HPLC Umckalin, 6,8-Dihydroxy-5,7-dimethoxycumarin, 5-Hydroxy-6,7-dimethoxycumarin-8-sulfat, Catechin/ Epicatechin, Gallocatechin/ Epigallocatechin, Gallocatechin-4α,8-epigallocatechin, Epicatechin- 4β,8-epigallocatechin, Gallocatechin-4α,6-gallocatechin and Epigallocatechin- 4β,8-epicatechin ingredients were isolated. Structures were established by spectroscopic methods (MS, NMR). Proanthocyanidins were in the focus of the work. In addition to the first detailed structural analysis of dimers of EPs® 7630, oligomeric compounds, mostly regarded as prodelphinidins, with up to six subunits could be detected mass spectrometrically. As a reaction product after acid hydrolysis the penta hydroxylated delphinidin was identified, in accordance with the data from the mass spectra. The spectroscopic and chemical studies of proanthocyanidins have been enhanced by the analysis of tannin content in the extract by the method in the Pharmacopoeia Europea (polyphenol content of ca. 22%). In addition to the known range of coumarins the discovery of further coumarins was another phytochemical aspect. In this context the unique presence of sulfated representatives could be demonstrated again. Information on new compounds was obtained from a mixture of 5-hydroxy-6,7-dimethoxycoumarin-8-sulfate and a monohydroxy-monomethoxy- cumarinsulfate. EPs® 7630 respectively the contained proanthocyanidins reduce the adhesiveness of group A streptococci by up to 47% (at an incubation concentration of 30 µg/ml). Here, the trihydroxylation of the B ring of the flavan-3-ol-subunits is of crucial importance for the activity, while the degree of polymerization plays a subordinate role. EPs® 7630 has a remarkably high inhibitory activity against neuraminidase (IC50 ca. 1 uGu/ml). The commercially available drugs zanamivir (IC50 ca. 18 µg/ml) and oseltamivir carboxylate (IC50 ca. 54 µg/ml) are considerably less active in the used in vitro model. The enzyme is significantly inhibited by proanthocyanidins, with a minimum chain length of three subunits.EPs® 7630 showed strong immune- stimulating properties on macrophages. Incubation of Leishmania infected macrophages with 30 µg/ml EPs® 7630 reduced the parasite load to 52%. The biocidal activity correlated well with the induced formation of •NO radicals and thus was not based on a direct toxic effect against Leishmania, but on the activation of cytotoxic immune mechanisms. Furthermore macrophages, incubated with EPs® 7630, were stimulated to secrete cytokines. While only TNF-α was detected by ELISA in the supernatants, but not IL-12 and IFN-γ. The uninfected (332 pg/ml) and infected (432 pg/ml) macrophages treated with EPs® 7630 produced high titers of TNF-α, compared to the positive control (IFN-γ plus LPS; 225 pg/ml uninfected (cells), 462 pg/ml (infected cells)). In addition, by the treatment of EMCV-infected IFN-sensitive L929 fibroblasts with the supernatants, a strong virus protection in the cells was induced. The potency was equivalent to about 24 U/ml of IFN-γ standards. This inhibition of the cytopathic effect is associated with interferon production, which was below the detection limit. Complementing existing work on the antioxidant potential of EPs® 7630, the extract has been tested as a scavenger of •NO radicals in a cell-free assay using SNP as •NO donor. The extract showed a scavenging potential with an IC50 value of 160 ug/ml (quercetin IC50 110 µg/ml), which is attributable to the content of polyphenols and oligomeric proanthocyanidins. For one thing, polyphenol free extracts proved to be inactive. On the other hand, the comparison with proanthocyanidins represented that the hydroxylation at the B ring of the flavan-3-ol subunit is an essential structural feature: prodelphinidins had a higher •NO scavenger potential than procyanidins.
