Platinum complexes are frequently employed in the therapy of several cancers such as testicular- and ovarian cancer. The first therapeutically used platinum complex, cisplatin, has been the subject of extensive research since its therapeutic potential was discovered in the Sixties. Ever since, a vast number of chemical modifications have been exploited with the aim to reduce the side effects and enhance cytotoxicity. New platinum complexes are often tested in cancer culture cells to evaluate their cytotoxic potential. To further characterize the complexes, other investigations such as whole cell uptake and subcellular distribution are often conducted e.g. amount in cell nuclei and/or binding to DNA. In the present work, emphasis has been given to the investigation of the subcellular distribution of four platinum complexes, cisplatin, m4FPtCl2, dl4FPtCl2 and mDAH4FPtCl (two platinum atoms). In previous works, these complexes have displayed differences regarding cytotoxicity, whole cell- and nuclei accumulation and binding to genomic DNA. To further investigate their subcellular distribution, different centrifugation methods were used in the present work to collect subcellular fractions from HeLa cells where flameless atomic absorption spectrometry was employed for the quantification of platinum. Moreover, the cross-resistance and whole cell associated platinum in MCF-7 cells with acquired resistance was investigated. The differences in subcellular distribution between the platinum complexes were small after 2 h of incubation and this was true for the recovered percentage in each fraction as well as for the protein normalized amounts. The highest platinum amount was found in the cell nuclei fraction (~ 10-25 % depending on the complex) but the differences in protein normalized amounts between the fractions were relatively small. It is suspected that the density gradient is too crude to differentiate between complexes with small differences in their subcellular distribution. The results from the western blot analysis of the subcellular fractions from the density gradient indicate that the peroxisomes might be damaged. Cryo-electron microscopy of the fractions led to the assumption that the integrity of the mitochondria is assaulted. It is believed that a gentler sample preparation method would better preserve organelle integrity and therefore increase gradient separation efficiency. Since the cell entry mechanism might affect the subcellular distribution, the role of three fluid-phase endocytosis mechanisms in whole cell accumulation of cisplatin, m4FPtCl2 and mDAH4FPtCl were investigated. Inhibitors of macropinocytosis and clathrin- and caveolin dependent endocytosis did not lower the cell associated platinum amounts for any of the tested complexes. The subcellular distribution of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) was different than for the platinum complexes (uptake in nuclei and plasma membrane fractions was not investigated) and a higher accumulation in fractions containing the lysosomal marker protein LAMP1 was seen. However, the results from the subcellular fractionation can only be used to show that the distribution is different for the enzyme than for the platinum complexes because of presumed lysosomal breakdown of HRP. The uptake of HRP was lowered by inhibitors of macropinocytosis and clathrin-dependent endocytosis. Thus, different cell accumulation mechanisms of the platinum complexes and the protein HRP might partly explain differences in subcellular distribution. Subsequent purification of the mitochondrial DNA after incubation of HeLa cells with the complexes, revealed all complexes to be associated with the DNA. If the whole cell accumulation data is considered, cisplatin is more efficiently bound to HeLa cell DNA compared to the other complexes. MCF-7 cells were cultivated in the presence of cisplatin, m4FPtCl2 and dl4FPtCl2 to acquire resistance. MCF-7 cells with resistance to cisplatin were not resistant to m4FPtCl2 or dl4FPtCl2. However, m4FPtCl2 displayed cross resistance to dl4FPtCl2 in cells tolerant against dl4FPtCl2. Whole cell associated platinum was lowered for cisplatin in cisplatin resistant cells. No obvious differences in cell uptake were seen for m4FPtCl2 and dl4FPtCl2 in any of the tolerant cell lines. It is postulated that the uptake of these complexes is not playing an important role in the resistance mechanisms but more experiments are required to confirm this.
Platinkomplexe haben eine wichtige Position in der heutigen Krebstherapie. Hoden- und Ovarialkrebs können damit erfolgreich behandelt werden. Cisplatin ist der erste therapeutisch verwendete Platinkomplex. Seit dem Entdecken seiner biologischen Wirkung in den sechziger Jahren, ist ein erhebliches Forschungsfeld im Gang gesetzt werden im welchen ein Vielzahl von chemischen Modifizierungen von Cisplatin untersucht worden sind. Das Ziel ist einen neuen Komplex mit erhöhter Zytotoxizität und weniger Nebenwirkungen zu finden. Um ihre Zytotoxizität zu bewerten, werden neue Platinkomplexe häufig in Zellkulturen von Krebszellen getestet. Weitere Methoden um der Interaktion zwischen biologisches Material und Platinkomplexe zu charakterisieren, sind Untersuchungen wie Zellaufnahme und subzelluläre Distribution wie z.B. Platinmengen assoziiert mit der Zellkern und/oder Bindung des Platins am Erbgut. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt an den Untersuchungen der subzellulären Distribution von den Platinkomplexen cisplatin, m4FPtCl2, dl4FPtCl2 und mDAH4FPtCl (zwei Platinatome). Vorherige Arbeiten haben gezeigt dass die Komplexe Unterschiede bezüglich Zytotoxizität, Assoziation mit Zellen, Zellnuklei und Bindung an der Zellulären DNA aufweisen. Um weitere Informationen über die subzelluläre Distribution der Komplexe zu erhalten, sind in der jetzigen Arbeit verschiedene Zentrifugierungsmethoden benutzt worden um subzelluläre Fraktionen von HeLa Zellen zu erhalten in welchen Platin mittels Atomabsorptionsspektrometrie quantifiziert worden sind. Die Unterschiede in subzellulärer Distribution zwischen den Platinkomplexen nach 2 Std Inkubationszeit waren klein. Dies galt für Prozentuale- sowie auf Protein normalisierten Platinmengen. Die höchsten Platinmengen sind in die Zellnukleifraktion gefunden worden (~ 10-25 % je nach Komplex) aber die Unterschiede zwischen Fraktionen mit auf Protein normalisierte Platinmengen waren relativ klein. Es wird vermutet dass der Densitätsgradient nicht fein genug ist um niedrige Unterschiede in subzellulären Verteilung zwischen Komplexe bemerkbar zu machen. Die Lage des peroxisomalen Markerprotein im Densitätsgradient lässt die Vermutung nahe, dass die Peroxisomen beschädigt sind. Cryo-elektronmikroskopische Analyse der Fraktionen weist darauf hin dass die Mitochondrien als nicht intakt vorliegen. Eine schonende Probenaufarbeitung wurde mutmaßlich die Organellenintegrität besser erhalten und infolgedessen den Abscheidegrad des Gradients erhöhen. Der Zellaufnahmemechanismus kann die subzelluläre Distribution beeinflussen und deswegen wurden drei Endozytosehemmer eingesetzt. Weder Hemmsubstanzen der Makropinozytose oder Hemmsubstanzen der klathrin- und kaveolinabhängige Endozytose konnte die Zellaufnahme von cisplatin, m4FPtCl2 oder mDAH4FPtCl beeinflussen. Das Enzym Meerettichperoxidase (HRP) unterschied sich von den Platinkomplexen in seiner subzellulären Distribution und höhere Anreicherung konnte in Fraktionen, die das lysosomale Markerprotein LAMP1 enthalten, gesehen werden. Dennoch können diese Ergebnisse nur benutzt werden um einen Unterschied zwischen Protein und Komplexe festzustellen. Wegen vermuteter lysosomaler Verdauung des Enzyms sind andere Aussagen ausgeschlossen. Die Zellaufnahme von HRP konnte durch Hemmung der Makropinozytose und der klathrinabhängige Endozytose erniedrigt werden. Demzufolge kann die unterschiedliche intrazelluläre Distribution von den Platinkomplexen und das Protein zumindest Teils von unterschiedlichen Zellaufnahmemechanismen erklärt werden. Quantifizierung des Platins in aufgereinigter mitochondrialer DNS nach Inkubation von HeLa-Zellen mit den Komplexen zeigte dass alle Komplexe mit der DNS assoziiert sind. Vorherigen Arbeiten haben markante Unterschiede in Zellakkumulierung zwischen den Komplexen in MCF-7 Zellen nach 24 Std festgestellt und cisplatin ist in Hinsicht auf die totale Platinmenge in den Zellen, am effektivsten an DNS gebunden. MCF-7 Zellen wurden entweder mit cisplatin, m4FPtCl2 oder dl4FPtCl2 kultiviert um Resistenz zu entwickeln. Die cisplatinresistente Zellen waren nicht resistent gegen m4FPtCl2 oder dl4FPtCl2. Allerdings zeigten m4FPtCl2 gewisse Kreuzresistenz gegen dl4FPtCl2 in Zellen mit Resistenz gegen dl4FPtCl2. Platinmengen waren niedriger in cisplatinresistente Zellen als in Kontrollzellen nach Inkubation mit cisplatin. Dementsprechend galt nicht für m4FPtCl2 oder dl4FPtCl2 in deren respektive resistenten Zelllinien. Es wird vermutet dass der Aufnahmeweg für diese Komplexe nicht mit in den Resistenzmechanismus mit beteiligt ist obwohl mehrere Experimente sind nötig um dies zu befestigen.
