The significance of in vivo protein studies is widely appreciated. Whereas in vivo protein behaviours inside cells are influenced by many unique physical parameters, such as macromolecular crowding and intracellular viscosity, they are also affected by a plethora of biological activities that often vary greatly in different cell types. In-cell NMR spectroscopy is an invaluable biophysical tool for residue-specific, structural and functional investigations of isotope-labeled proteins inside native environments of cells and, as such, a preferred tool for studying intracellular proteins behaviours. Despite the great potential of in-cell NMR applications, the method is most commonly used for prokaryotic in-cell NMR measurements in E.coli cells, while in-cell NMR studies in eukaryotic cells are have been limited by the sparse availability of suitable cellular model systems. The primary goal of this thesis was to extend the general applicability of eukaryotic in-cell NMR measurements to also include mammalian cells and to develop a generic protocol for the efficient delivery of isotope-labeled proteins into mammalian cells. Results demonstrate that low transduction efficiencies, high cell line dependences and vesicular-like intracellular distributions strongly limited the suitability of CPP-mediated protein delivery attempts. Although SLO- and EP-procedures yielded comparable transduction efficiencies at low applied protein concentrations, EP clearly outperformed the SLO approach at higher protein concentrations, because it enabled the linear delivery of increasing concentrations of exogenous proteins, with high correlations in intracellular cellular protein levels. In the second part of the thesis, I provide a first time description of the structural, dynamic and functional details of a human amyloid protein, alpha synuclein and its isoforms beta- and gamma synuclein inside different mammalian cells, as determined by high-resolution in-cell NMR experiments. Alpha synuclein, a small (14.5 kDa) intrinsically disordered neuronal protein is known to accumulate into cytosolic filamentous inclusions of dopaminergic neuronal cells14 in the course of neurodegenerative disorders termed synucleinopathies. High-resolution in-cell NMR studies were performed to provide novel insights into the native in vivo properties of this protein, especially in relation to its physiological and pathological properties, such as intracellular aggregation, membrane association and post-translation modifications. The choice of mammalian cells models included disease-unrelated (i.e. HeLa and A2780 cells) and disease-related dopaminergic neuronal cell lines (i.e. B65 and SK-N-SH cells). Because dopaminergic neurons of the substantia nigra (SN) are particularly affected in Parkinson’s disease patients, a SN-derived rat cell line, i.e. RCSN3 cells was additionally employed in this study. High-resolution 2D 1H-15N SOFAST-HMQC spectra of the Synuclein protein family revealed monomeric appearances in five different mammalian cell lines, with no indications for significant conformational change, such as amphipatic helical conversions, or aggregations into beta- sheet rich, high molecular weight oligomers, or amyloid fibrils. Despite their disordered and monomeric characteristics, similar but not identical site- selective line broadening effects were observed, which affected the first ten N-terminal residues in alpha-, as well as beta -, and gamma synuclein. N-terminal acetylation, a constitutive post-translational modification in mammals, was uniformly detected in alpha synuclein and its isoforms in all tested cell lines. Phosphorylation of Ser129 of alpha synuclein was observed at very low levels in Western blotting, but not by in-cell NMR measurements. The excellent spectral qualities of the Synuclein protein family in-cell NMR specimens obtained under healthy physiological conditions, hold great promises for future in-cell NMR studies under pathogenic conditions related to Parkinson’s disease and the development of cell based in-cell NMR models for investigating the intracellular aggregation behaviours of these-, and other proteins.
Die Wichtigkeit von in vivo Studien wird weithin hoch eingeschätzt. Während das Verhalten der Proteine innerhalb der Zellen durch viele einzigartige physische Parameter wie makromolekulare Häufung und intrazellulare Zähflüssigkeit beeinflusst wird, wird es auch von einer großen Zahl von biologischen Aktivitäten beeinträchtigt, die oft sehr zwischen Zelltypen variieren. Intrazellulare NMR Spektroskopie ist ein sehr wertvolles biophysisches Rückstand- spezifisches Tool für strukturale und funktionale Untersuchungen von Isotop-markierten Proteinen in der ursprünglichen Umgebung der Zellen und damit ein bevorzugtes Werkzeug für die Untersuchung der intrazellulären Verhaltensweisen der Proteine. Trotz der potentiell großen Einsatzmöglichkeiten von in-cell NMR wird die Methode hauptsächlich für prokaryotische in-cell NMR-Messungen in E.coli-Zellen benutzt. Allerdings sind die Möglichkeiten von in-cell NMR Messungen in eukaryotischen Zellen wegen der wenigen verfügbaren geeigneten Zellmodell-Systeme begrenzt. Als Primärziel meiner These wollte ich die Einsetzbarkeit der eukariotischen in-cell NMR- Messungen auf die Säugetier-Zellen erweitern und ein Generisches Protokoll für die effiziente Lieferung Isotop-markierter Proteine in die Säugetier-Zellen entwickeln. Die Ergebnisse zeigen, dass niedrige Transduktionseffizienzen, hohe Zelllinienabhängigkeiten und vesikular-ähnliche intrazelluläre Verteilungen die Anwendbarkeit von CPP-vermittelten Proteinlieferversuchen stark einschränken. Obwohl SLO- und EP- Prozeduren vergleichbare Transduktionseffizienzen bei niedrigen Proteinkonzentrationen ergaben, war die EP- Methode bei höheren Proteinkonzentrationen eindeutig besser als der SLO- Ansatz, weil sie die lineare Lieferung vom immer höheren Konzentrationen von exogenen Proteinen ermöglichte, und dies bei hohen Korrelationen in intrazellularen Proteinniveaus. Im zweiten Teil der These liefere ich eine erstmalige Beschreibung der strukturellen, dynamischen und funktionellen Details eines humanen Amyloidproteins, alpha Synuklein (Syn), und seiner Isoformen beta- und gamma-Synuklein in verschiedenen Säugetier- Zellen, so wie sie durch hochresolutions in-cell NMR-Experimente festgestellt werden. Alpha Syn, ein kleines (14.5 kDa) intrinsisch desorganisiertes neuronales Protein ist dafür bekannt, dass es sich im Verlaufe von Synukleinopathie genannten neurodegenerativen Krankheiten in zytosolische, filamentöse Inklusionen dopaminergischer Neuronenzellen sammelt. Hochresolutions in- cell NMR-Studien wurden durchgeführt, um neue Einsichten in die angeborenen in vivo Eigenschaften dieses Proteins zu erlauben, insbesondere mit Hinblick auf seine physiologischen und pathologischen Eigenschaften, so wie intrazellulare Aggregation, Membrane Assoziation und Post-translations Veränderungen. Die Auswahl von Säugetier-Zell-modellen umfasste sowohl Krankheitsunberührte (i.e. HeLA und A2780-Zellen) als auch Krankheitsberührte dopaminergische neuronale Zellinien (i.e. B65 und SK-N-SH-Zellen). Weil dopaminergische Neuronen der substantia nigra (SN) in Parkinsonpatienten besonders betroffen sind, wurde eine SN-abgeleitete Rattenzelllinie, i.e. RCSN3-Zellen, zusätzlich in diese Studie aufgenommen. Hochresolutions 2D 1 H-15N SOFAST-HMQC-Spektren der Synukleinproteinfamlie zeigten monomerische Erscheinungen in fünf verschiedenen Säugetier-Zell-linien, mit keinerlei Anzeichen bedeutender konformationeller Veränderung, wie z.B. amphobatische helikale Konversionen oder Aggregationen in Beta-Blatt-reiche, hochmolekulargewichtige Oligomere oder Amyloidfibrile. Trotz ihrer desorganisierten und monomerischen Charakteristika wurden ähnliche aber nicht identische ortsspezische Erweiterungseffekte beobachtet, die die ersten zehn N-Terminalresiduen in alpha- als auch beta - und gamma Syn betrafen. N-Terminal Acetylation, eine konstitutive Post-Translationale Veränderung in Säugetieren wurde überall in alpha Syn und seinen Isoformen in allen getesteten Zelllinien entdeckt. Phosphorylation der Ser129 einer alpha Syn-Phosphorylation wurde in sehr geringem Ausmaß in Western blotting, aber nicht in intrazellularen NMR- Messungen entdeckt. Die ausgezeichneten spektralen Qualitäten der Synuklein- in- cell NMR-Stichproben, die unter gesunden physiologischen Bedingungen erhalten wurden, zeigen hohes Potential für zukünftige intrazellulare NMR- Studien unter pathogenischen Bedingungen wie bei der Parkinsonschen Krankheit und die Entwicklung Zellbasierter, intrazellularer NMR Modelle zur Untersuchung des Aggregationsverhaltens dieser und anderer Proteine.
