In this thesis, phosphonites were investigated as an alternative functionalization tool in Staudinger reactions. Firstly, different aryl phosphonites bearing a model functional mOEG group at the aromatic ring were synthesised with various alkoxy substituents including alkyl and small mOEG groups. To protect the phosphonites against oxidation or hydrolysis during purification and storage, a borane protection group was introduced, which can be cleaved off with DABCO prior to the Staudinger reaction. Subsequently, the mOEG-functionalized phosphonites were probed in the Staudinger reaction with fully unprotected azido peptides in buffer systems with up to 92% conversion of the azido peptide. As the most important result, the first successful functionalization of the protein calmodulin bearing a p-azidophenylalanine at position 2, via the Staudinger-phosphonite reaction was accomplished. In order to develop a general synthesis pathway for functionalized phosphonites and to ease the introduction of various functional modules such as fluorophores, carbohydrates etc., a second generation of phosphonites was established. The aromatic system was replaced by an alkyne substituent, which allows the introduction of the functional module by CuAAC. The CuAAC does not interfere with any other functional groups of both, the functional module and the protected phosphonite. It is most important to acknowledge that after CuAAC reaction and purification copper-free borane-protected tetrazole phosphonites were obtained. It can be concluded that this new reaction protocol stands out for its high flexibility with regard to the introduction of the functional module and its short reaction sequence. Afterwards, the second generation of phosphonites was investigated in-depth with respect to different functional modules and their behaviour in Staudinger reactions in organic solvents. It could be demonstrated that a wide variety of functional modules could be attached to the alkyne phosphonite and even very challenging phosphonites such as unprotected carbohydrate phosphonites were accessible. These phosphonites were successfully utilised in Staudinger reactions with different azides. The synthesized carbohydrate tetrazole phosphonite was converted with azido polyglycerol to obtain a carbohydrate functionalized polymer, which showed excellent binding in a SPR-based peanut agglutinin–carbohydrate binding assay. During the Staudinger-phosphonite reaction with aryl azides, the formation of the corresponding aryl amines was observed as a side product. Their formation could be explained by unselective hydrolysis of the phosphonimidate leading to the amino peptide and a phosphonate. This hypothesis was proven by the hydrolysis of the corresponding phosphonimidate with 18O-labelled water. This result provides additional insight into the mechanism of the Staudinger reaction. After successful application of the Staudinger-phosphonite reaction in organic solvents, the reaction was transferred to aqueous buffer systems. To achieve a good solubility in water and an increased stability against hydrolysis, phosphonites with oxy-bound mOEG2 as well as p mOEG-m-nitrobenzyl substituents at the oxygen were synthesized. The new triazole phosphonites showed a three- to five-fold enhancement in stability against hydrolysis compared to the first generation of phosphonites. To study the conversion of azido peptides at low concentrations, either fluorophore-tagged peptides were used and the resulting product mixture was analysed by HPLC-fluorescence, or conversions were determined by quantitative mass spectrometry with deuterated peptide as internal standard. These studies revealed that the best conversion of azido peptides was achieved in 100 mM tris / HCl buffer at a pH of 8.2, at an azido peptide concentration of 50 μM and with 250 to 500 equivalents of phosphonite in dependence on the oxy-bound substituents. Finally, the previous findings on the Staudinger-phosphonite reaction with tetrazole phosphonites were applied for the biotinylation of Rasa1-N. The biotinylated protein was immobilized onto Streptavidine-coated magnetic beads and phosphorylation binding studies were performed.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Phosphonite als Alternative zu den bereits untersuchten Phosphiten hergestellt und auf ihre Anwendbarkeit in der Staudinger Reaktion untersucht. Zunächst wurden Arylphosphonite mit unterschiedlichen Alkoxysubstituenten synthetisiert. Um eine Oxidation oder Hydrolyse der Phosphonite während der Synthese zu verhindern, wurde eine Boran-Schutzgruppe eingeführt, welche im letzten Schritt unter Verwendung von DABCO vor der nachfolgenden Staudinger Reaktion wieder abgespalten werden konnte. Die Anwendung der ungeschützten mOEG-funktionalisierten Phosphonite wurde nachfolgend in der Staudinger Reaktion mit ungeschützten Azidopeptiden in verschiedenen Puffersystemen getestet, wobei ein Umsatz der Azidopeptide von bis zu 92% beobachtet werden konnte. Anschließend konnte durch erfolgreiche Umsetzung des Proteins Calmodulin, in welches an Position 2 anstelle von Tyrosin p-Azidophenylalanin eingebaut wurde, die erste erfolgreiche Funktionalisierung eines Proteins mittels der Staudinger- Phosphonite Reaktion gezeigt werden. Um einen einfacheren Zugang zu den funktionalisierten Phosphoniten zu ermöglichen, wurde eine modulare Synthese für eine zweite Generation von Phosphoniten entwickelt. Diese modulare Synthese ermöglicht es, auch komplexe funktionalen Einheiten, wie Fluorophore, PEG-Gruppen und Kohlenhydrate ohne komplizierte Schutzgruppenmanipulationen einzuführen. Dazu wurde das aromatische System gegen ein Alkin ausgetauscht, welches die Einführung einer funktionalen Einheit über CuAAC ermöglicht. Die CuAAC zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass keine Kreuzreaktion mit anderen funktionellen Gruppen, hier der funktionalen Einheit und des Phosphonits, auftreten. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass nach der CuAAC Reaktion das erhaltene Borane geschützte Phosphonit vollständig vom Kupfer- Katalysator befreit werden konnte. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass sich das neu entwickelte Syntheseprotokoll unter Verwendung der Alkinphosphonite durch seine hohe Flexibilität bezüglich der einzuführenden funktionalen Einheit und durch den einfachen und kurzen Syntheseweg auszeichnet. Diese zweite Generation von Phosphoniten wurde in grundlegenden Studien bezüglich der Zugänglichkeit von Triazol-Phosphoniten und deren Verhalten in der Staudinger-Reaktion in organischen Lösungsmitteln untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine große Vielfalt an funktionalen Einheiten und sogar ungeschützte Zuckerphosphonite zugänglich waren. All diese Phosphonite konnten anschließend erfolgreich in Staudinger-Reaktionen mit unterschiedlichen Aziden in sehr guten Ausbeuten umgesetzt. Darüber hinaus konnte auch ein Azidopolyglycerol mit dem Laktose-Triazol-Phosphonit umgesetzt und ein glykosyliertes Polymer erhalten werden. Anschließende SPR-Messungen zeigten exzellente Bindung des Laktose-Phosphonamidat-Polyglycerol in einem Lektin- peanut agglutinin (PNA) Bindingsassay. Allerdings wurde bei der Staudinger- Phosphonit-Reaktion mit Arylaziden die Entstehung eines Arylamins beobachtet, welches durch eine unselektive Hydrolyse des Phosphonimidates erklärt werden kann. Diese Hypothese konnte mit Hilfe von 18O-markiertem Wasser bewiesen werden. Dieses Resultat brachte neue Erkenntnisse bezüglich des Mechanismus der Staudinger-Reaktion. Nach der erfolgreichen Verwendung der Alkin- Phosphonite in organischen Lösungsmitteln, wurde die Reaktion auf wässrige Puffersysteme übertragen. Dafür wurden Phosphonite sowohl mit mOEG als auch mit p-Nitrobenzyl-Substituenten an den Sauerstoffen des Phosphonits hergestellt, um die Wasserlöslichkeit und Stabilität der Phosphonite zu verbessern. Diese neuen Phosphonite zeigten dabei eine drei- bis fünffach höhere Stabilität gegen Hydrolyse. Ferner wurde die Umsetzung dieser Phosphonite mit unterschiedlichen Azidopeptiden unter Veränderung der Azid-, Phosphonit- und Pufferkonzentration sowie der pH-Werte untersucht und die Umsetzung entweder mit HPLC-Fluoreszenz oder über quantitative Massenspektrometrie analysiert. Diese Studien zeigten, dass das beste Ergebnis der Staudinger-Phosphonit-Reaktion in einem 100 mM tris / HCl Puffer bei einem pH-Wert von 8.2, einer Peptid Konzentration von 50 μM und 250 bis 500 Äquivalenten an Phosphonit erhalten werden konnte. Abschließend wurde die Staudinger-Phosphonite-Reaktion mit Triazol-Phosphoniten zur biotinylierung von Rasa1-N verwendet. Das biotinylierte Protein wurde auf magnetischen-Beads immobilisiert um anschließend bindungsstudien mit phosphoryliertem ADAD-P durchzuführen.
