EINFÜHRUNG Virale Infektionen sind häufig kritische Komplikationen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Adenoviren (AdV) und Herpesviren sind die häufigsten und schwerwiegendsten Ursachen opportunistischer Infektionen bei diesen immunsupprimierten Patienten. Reaktivierungen durch humane AdV treten vor allem bei Kindern nach allogener HSCT auf und bei disseminierender AdV-Erkrankung ist eine hohe Morbidität und Mortalität die Folge. Adoptive Immuntherapien, z. B. mit AdV-spezifischen T-Zellen, stellen eine Therapieoption dar. METHODEN Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst nach sechsstündiger Stimulation von je 1 ml Vollblut mit AdV- Antigenen (AdV3-Hexonprotein und AdV3-Hexon-Peptiden) und Anti-Human CD28 bei 23 gesunden Probanden AdV-spezifische T-Zellen mittels Durchflusszytometrie identifiziert und analysiert. Durch Einsatz eines Interferon gamma (IFNγ )-Sekretions-Assays wurden AdV3-Hexon-Peptidspezifische, IFNγ sezernierende T-Zellen nach einer sechsstündigen Stimulation mononukleärer Zellen mit AdV3 -Hexon-Peptiden und anschließender immunmagnetischer Markierung mit dem CliniMACS® Separator isoliert. Diese Arbeit zeigt vorab eine Entwicklung und Optimierung technischer Standards in sieben Experimenten, gefolgt von einer Analyse der angereicherten AdV spezifischen T-Zellen. RESULTATE Nach Vollblutstimulation wurden im Median innerhalb der Lymphozytenpopulation 0,07 % AdV3-Hexon-Peptid- und 0,08 % AdV3-Hexonprotein-spezifische CD4+IFNγ+ T-Zellen und 0,01 % AdV3-Hexon-Peptid-spezifische CD8+IFNγ+ T-Zellen nachgewiesen. In der Analyse von Antigen-induzierter CD154 Expression bei CD4+ und CD69 bei CD8+ T-Lymphozyten plus IFNγ halbierten sich die medianen Frequenzen AdV-spezifischer T-Zellen (0,04 % AdV3-Hexon-Peptidund 0,03 % AdV3 -Hexonprotein-spezifische CD4+CD154+IFNγ+ und 0,01 % AdV3-Hexon-Peptidreaktive CD8+CD69+IFNγ+ T-Zellen). Zusammengefasst sind AdV3-Hexonprotein wie auch die AdV3-Hexon-Peptid-Mischung in gleicher Weise geeignet, spezifische CD4+ und CD8+ Zellen zu stimulieren. Dabei lassen sich bei gesunden Probanden im Mittel deutlich mehr AdV-spezifische CD4+ als CD8+ T-Zellen nachweisen. Weiterhin zeigte sich, dass AdV-spezifische T-Zellfrequenzen mit steigendem Alter fallen. Ausgehend von 100 ml humanem Vollblut wurde eine mediane Zahl von 90 × 106 mononukleären Zellen (Range: 70 – 240 × 106) mit AdV3-Hexonpeptiden stimuliert. Nach dem IFNγ-Sekretions-Assay und der immunmagnetischen Anreicherung wurde eine mediane Zahl von 88 × 103 (Range: 2,2 – 640 × 103) AdV-spezifischen, IFNγ sezernierenden Zellen isoliert. Die phänotypische Analyse des AdV-spezifischen T-Zell-Produkts mittels Durchflusszytometrie identifizierte im Median 45 % AdV-spezifische CD4+IFNγ+ T-Zellen und 7,8 % AdV-reaktive CD8+IFNγ+ T-Zellen innerhalb der CD3+ T-Zell-Population. Die Entwicklung und Optimierung technischer Standards ergab tendenziell konsistentere Werte der Recovery aller mononukleären Zellen bei Passagierung der Zellen in Röhrchen statt Beuteln und Weglassen der Vorfiltrierung. FAZIT Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass AdV-spezifische T-Zellen nach Vollblutstimulation mit AdV-Antigenen bei gesunden Probanden detektiert werden können. AdV-spezifische T-Zellen können mittels IFNγ-Sekretions-Assay und immunmagnetischer Separation angereichert werden. Da die absoluten Zellzahlen aus einem Ausgangsvolumen von 100 ml Vollblut aufgrund der niedrigen Frequenzen AdV-spezifischer T-Zellen gering sind, wird eine Expansion dieser angereicherten Zellen erforderlich sein, um suffiziente Zahlen für adoptive Immuntherapien zu erhalten.
INTRODUCTION Viral infections are often critical complications after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. Adenoviruses and herpesviruses are the most frequent and severe causes of opportunistic infections in these immunosuppressed patients. Reactivations by human AdV occur especially in children after allogeneic HSCT and a disseminating AdV disease contributes to a high morbidity and mortality Adoptive immunotherapies, e. g. with AdV-specific T cells, are therapeutic options. METHODS In the context of this work it was at first made an identification and analysis by flow cytometry of AdV-specific T cells in 23 healthy human donors after a 6-hour stimulation of 1 ml of whole blood with AdV antigens (AdV3-hexon protein and AdV3-hexon peptides) and anti human CD28. Using an interferon gamma (IFNγ) secretion and capture assay AdV3-hexon-peptide- specific, IFNγ secreting T cells were isolated with the CliniMACS® instrument after a 6-hour stimulation of mononuclear cells with AdV3-hexon peptides and following immunomagnetic labelling. This work shows initially a development and an optimization of technical standards in 7 experiments followed by analysis of the enriched AdV-specific T cells. RESULTS After stimulation of whole blood a median frequency of 0.07 % AdV3-hexon-peptide- and 0.08 % AdV3-hexon protein-specific CD4+IFNγ+ T cells and 0.01 % AdV3-hexon-peptide- specific CD8+IFNγ+ T cells within the lymphocyte population could be identified. Analyzing antigen induced CD154 expression in CD4+ and CD69 in CD8+ T lymphocytes plus IFNγ the median frequencies of AdV-specific T cells halved (0.04 % AdV3-hexon-peptide- and 0.03 % AdV3-hexon proteinspecific CD4+CD154+IFNγ+ and 0.01 % AdV3-hexon-peptide-reactive CD8+CD69+IFNγ+ T cells). In summary AdV3-hexon protein and AdV3-hexon-peptide are similarly suitable to stimulate specific CD4+ und CD8+ T cells. On average there are more AdV-specific CD4+ than CD8+ T cells in healthy donors. Furthermore it is shown that the AdV-specific T cell frequencies decrease with increasing age. Starting with 100 ml human peripheral blood a median number of 90 × 106 mononuclear cells (range: 70 – 240 × 106) was stimulated with AdV3-hexon- peptides. After the IFNγ secretion assay and immunomagnetic enrichment a median number of 88 × 103 (range: 2.2 – 640 × 103) AdV-specific, IFNγ secreting cells was isolated. Phenotypical analysis of the AdV-specific T cell product by flow cytometry identified a median of 45 % AdV-specific CD4+IFNγ+ T cells and 7.8 % AdV-reactive CD8+IFNγ+ T cells within the CD3+ T cells. The development and optimization of technical standards showed by trend more consistent data regarding recovery of mononuclear cells by using of tubes instead of bags and leaving out preseparation filters. CONCLUSION In summary this work shows that AdV-specific T cells can be detected after peripheral blood stimulation with AdV antigens in healthy donors. AdV-specific T cells could be enriched using an IFNγ secretion and capture assay and an immunomagnetic separation. As the absolute cell numbers using 100 ml whole blood as initial volume are low due to low frequencies of AdV-specific T cells a further expansion of these enriched cells will be required to recieve a sufficient number of cells for adoptive immunotherapy.
