Einleitung: Das Norrie-Syndrom ist eine X-chromosomal vererbte Erkrankung mit angeborener Blindheit, oftmals assoziierter Taubheit und geistiger Retardierung. Aus Elektroretinogramm (ERG) Ableitungen lässt sich eine Beteiligung des retinalen Pigmentepithels (RPE) an der Pathogenese nicht ausschließen. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik Kalzium- und Kaliumkanäle an kultivierten RPE Zellen von Wildtyp- und transgenen Mäusen mit Norrie-Gendefekt gemessen und verglichen. Ziel war, eine potentielle Dysfunktion des RPE bei Norrie-Mäusen zu erfassen und damit eine mögliche ätiologische Beteiligung an der retinalen Degeneration zu beschreiben. Methoden: Kulturen von RPE-Zellen von Wildtyp-Mäusen und transgenen Mäusen mit Norrie- Gendefekt wurden angelegt 12-14 Tage nach Geburt. Zellen wurden elektrophysiologisch analysiert mittels Patch-Clamp- Technik in der Whole-Cell-Konfiguration. Immunozytochemie wurde zum weiteren Nachweis der Ionenkanalidentität angewandt. Ergebnisse: Die durchschnittliche Membrankapazität aller gemessenen Zellen betrug 120.9 ± 6.5 pF (n=103). Ca2+ Ströme wurden gemessen und konnten anhand ihrer Spannungs-abhängigkeit, Stromkinetik, Nifedipine-Sensitivität und immunozytochemischem Nachweis der α1D-Untereinheit als L-type Ca2+ Kanäle identifiziert werden. Der L-type Ca2+ Kanal konnte durch den Tyrosinkinase-Hemmer Genistein sowohl bei Wildtyp- als auch bei Norrie-Mäusen gehemmt werden. Bei Untersuchungen zu Kaliumkanälen zeigten die meisten Zellen einen auswärtsrektifizierenden Strom mit typischer Charakteristik von Delayed-Rectifier K+ Kanälen, deren Identität mittels immunozytochemischen Nachweis der Kv1.3-Untereinheit bestätigt werden konnte. Das Ruhemembranpotential am RPE von Norrie-Mäusen betrug - 40.0 ± 6.9 mV (n=7), was ohne signifikanten Unterschied zu den Werten von Kontrollmäusen war (- 37.6 ± 3.5 mV (n=7)). Der Delayed-Rectifier artige K+ Kanal ließ sich an RPE-Zellen sowohl von Norrie- als auch von Wildtyp-Mäusen durch Genistein reversibel hemmen, wodurch seine Regulation durch Tyrosinkinasen nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerung: Im Vergleich der elektrophysiologischen Charakteristik der L-type Ca2+ Kanäle und der Delayed-Rectifier artigen K+ Kanäle zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen RPE- Zellen von Norrie-Mäusen und Wildtyp-Mäusen. Jedoch repräsentieren die Ergebnisse eine Erstbeschreibung von elektrophysiologischen Untersuchungen zur Ionenkanalcharakterisierung von RPE-Zellen von Mäusen. In Anbetracht der Möglichkeiten der Transgenese bei Mäusen und der generell weit verbreiteten Nutzung als Tiermodell kommt dieser Charakterisierung von Maus RPE-Zellen eine besondere Bedeutung zu. Die hier charakterisierten Ionenkanäle sind mit denen in der Literatur an RPE-Zellen von Ratte, Rind und Mensch beschriebenen vergleichbar.
Introduction: Norrie disease is an X-linked recessive disorder characterized by congenital blindness often coupled with deafness and mental retardation. Electroretinogram (ERG) studies indicate that the retinal pigment epithelium (RPE) might be involved in ocular pathogenesis. We compared calcium and potassium channels of cultured RPE cells of wild-type and transgenic mice with Norrie disease to find out whether altered channel characteristics are involved in RPE-dysfunction and the etiology of retinal degeneration. Methods: RPE cells from wild-type mice and Norrie mutant mice were analyzed using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique. We compared basic properties of calcium and potassium conductances. In addition, ion channels were characterized by subunit-directed immunocytochemistry. Results: Membrane capacitance of investigated RPE cells was 120.9 ± 6.5 pF (n=103). Ca2+ currents could be identified as currents through L-type Ca2+ channels by means of voltage-dependence, current kinetics, nifedipine sensitivity and detection of the α1D-subunit by immunocytochemistry. Application of the tyrosine kinase inhibitor genistein caused a decrease in L-type current amplitudes in both cell populations. Examining K+ channels, most cells showed outwardly rectifying whole-cell currents with characteristics typical for delayed rectifier K+ channels, which was verified by Kv1.3-subunit-directed immunostaining. Resting membrane potential was - 40.0 ± 6.9 mV (n=7) in RPE from Norrie mice and did not differ significantly from control cells with - 37.6 ± 3.5 mV (n=7). The delayed-rectifier current amplitude could be reversibly reduced by genistein in Norrie cells as well as in wild type controls. Conclusions: Comparing general features of L-type Ca2+ channels and delayed rectifier K+ channels, no significant difference could be observed between RPE cells from Norrie mice and wild type mice. However, this study presents for the first time the culture of murine RPE cells and presents electrophysiological data on these cells. Using mice as a new animal model for investigating RPE function can break new ground for future experiments, especially by means of transgenic or knock out mice. In addition, this study revealed that the electrophysiological characteristics for L-type Ca2+ channels and delayed rectifier K+ channels are comparable with data from human RPE cells and cells from established animal models like rat and cow.
