Phosphoinositides (PIs) are a minor class of short-lived phospholipids that serve as crucial signposts of membrane identity. Thereby, PIs full fill important functions in cell signaling and membrane transport. PI 4-phosphates such as phosphatitylinositol-4-phosphate (PI(4)P) and phosphatitylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) are enriched at the plasma membrane (PM), on secretory organelles and lysosomes, while PI 3-phosphates, i.e. phosphatitylinositol-3-phosphate (PI(3)P), are a hallmark of the endosomal system. Directional transport between these compartments, thus, requires regulated PI conversion. However, PI conversion in exit from PI(3)P-enriched endosomes en route to the PI(4)P- and PI(4,5)P2-positive PM in endosomal recycling remained unknown. Here, we report that cargo exit from endosomes requires removal of PI(3)P by the PI(3)P 3-phosphatase myotubularin 1 (MTM1), and concomitant PI(4)P synthesis by PI 4-kinase type II α (PI4K2α). Loss of MTM1 causes endosomal accumulation of PI(3)P and PI(3)P effector proteins, i.e. sorting nexins, Kif16b-mediated outward traffic of PI(3)P containing endosomes and sub-plasmalemmal accumulation of exocytosis-deficient endosomes. As PI4K2α associates with MTM1 and thereby facilitates membrane recruitment of MTM1, these phenotypic changes are mimicked by loss of PI4K2α. The conversion of PI(3)P-to-PI(4)P is paralleled by a switch in Rab GTPase- identity from early endosomal Rab5 to recycling endosomal Rab11. This conversion mechanism is driven by coincident detection of Rab GTPase and PI content as well as by reciprocal interactions among its components, including the association of exocyst with PI4K2α and PI(4)P, Rab11 and with MTM1. Thus, distinct recycling endosomal domains, characterized by PI4K2α, its lipid product PI(4)P, MTM1 and Rab11, are created destined for exocyst recruitment and subsequent exocyst-dependent fusion with the PM. A similar PI conversion mechanism involving myotubularin family members may underlie cargo exit from endosomes towards late endosomes. Importantly, MTM1 depletion and XLCNM- patient mutations are functionally correlated as patient fibroblast are exocytosis deficient and accumulate endosomal β1-integrin. Our data, thus, suggest that defective PI conversion at endosomes may account for the disturbed muscle morphology and impaired integrin-dependent muscle attachment in developing muscle fibres in XLCNM-patients. These integrin localization defects can be reversed by application of a Vps34-specific inhibitor and thus offer a potential avenue to combat this devastating disease.
Phosphoinositide (PI) sind eine seltene Gruppe von kurzlebigen Phospholipiden, die als Organisationsprinzip von Membranen hervorgetreten sind und Zellmembranen ihre Identität verleihen. Hierdurch erfüllen sie essentielle Funktionen in der Signaltransduktion und dem Membrantransport. PI 4-Phosphate wie Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI(4)P) und Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PI(4,5)P2) sind an der Plasmamembran (PM), auf sekretorischen Organellen und Lysosomen angereichert, während PI 3-Phosphate, z.B. Phosphatidylinositol-3-Phosphat (PI(3)P), das Endomembransystem kennzeichnen. Gerichteter Transport zwischen diesen Kompartimenten benötigt daher die kontrollierte Konversion von PIs. Dennoch ist die PI Konversion auf dem Weg von PI(3)P-reichen Endosomen hin zur PI(4)P- und PI(4,5)P2-angereicherten PM in endosomalem Recycling nur unzureichend verstanden. In dieser Studie legen wir dar, dass der Austritt von Cargoproteinen aus Endosomen die Entfernung von PI(3)P durch die PI(3)P 3-Phosphatase Myotubularin 1 (MTM1) benötigt sowie die anschließende Synthese von PI(4)P durch PI 4-Kinase Typ II α (PI4K2α). Der Verlust von MTM1 führt zur endosomalen Akkumulation von PI(3)P und PI(3)P-Effektoren, zum Kif16b- vermittelten auswärtsgerichteten Transport von PI(3)P-reichen Endosomen und der Akkumulation von Exozytose-defizienten Endosomen unterhalb der PM. Da PI4K2α mit MTM1 assoziiert und hierdurch die Rekrutierung von MTM1 auf endosomale Membranen ermöglicht, spiegelt der Verlust von PI4K2α diese phenotypischen Veränderungen wider. Die Konversion von PI(3)P zu PI(4)P wird begleited durch einen Wechsel in der Identität der Rab GTPasen. Hierbei wird der frühe endosomale Marker Rab5 durch den Marker für Recycling-Endosomen, Rab11, ersetzt. Dieser Konversionsmechanismus wird angetrieben durch die Koinzidenz-Detektion von Rab GTPasen und PIs sowie durch reziproke Interaktionen zwischen den Komponenten. Diese beinhalten die Assoziation des Exozyst-Komplexes mit PI4K2α und PI(4)P, Rab11 und mit MTM1. Hierdurch werden endosomale Subdomänen für endosomales Recycling geschaffen, die durch PI4K2α, dessen Lipidprodukt PI(4)P, Rab11 und MTM1 gekennzeichnet sind. Auf diesen Subdomänen kann der Exozyst-Komplex assembliert werden, in dessen Abhängigkeit exozytische Vesikel mit der PM fusionieren. Ein ähnlicher PI Konversionsmechanismus, der Myotubularine beinhaltet, könnte den Austritt von Cargoproteinen aus frühen Endosomen hin zu späten Endosomen kontrollieren. Wesentlich hierbei ist, dass der Verlust von MTM1 und XLCNM-assoziierte Mutationen funktionell stark korrelieren. Fibroblasten von XLCNM-Patienten zeigen Exozytosedefekte und akkumulieren β1-Integrin in Endosomen. Unsere Daten legen daher nahe, dass defekte PI Konversion auf Endosomen für die gestörte Muskelmorphologie und Defizite in der Integrin-basierten Muskeladhäsion in sich entwickelnden Muskeln von XLCNM Patienten verantwortlich ist. Diese Misslokalisation von Integrinen kann in Zellkultur durch die Behandlung mit einem Vps34-spezifischen Inhibitor aufgehoben werden und stellt dadurch eine Möglichkeit dar, dieser unheilbaren Krankheit entgegen zu wirken.
