Marek’s disease virus (MDV) is a highly oncogenic alphaherpesvirus that causes Marek’s disease (MD) in chickens. Infection of susceptible birds with virulent strain results in economic loss due to a high mortality, visceral lymphomas, paralysis and immunosuppression. The MDV genome encodes a CXC chemokine (vIL-8) that was named after the first identified chicken interlukin-8 (cCXCL8) based on the sequence similarity. However, recent functional data suggest that vIL-8 is not a cCXCL8 homologue. Identification of the cellular orthologue and receptor of vIL-8 are needed to understand its role in MDV pathogenesis. In the first part of this thesis, the evolutionary relationship was analyzed and vIL-8 functions characterized in vitro. Phylogenic and amino acid analysis of vIL-8 and all so far known human and chicken CXC chemokines revealed that vIL-8 lacks the conserved ELR (Glutamic acid- Leucine- Arginine) motif of CXC chemokines. The analysis also demonstrated vIL-8 has the highest sequence homology to cCXCL13L1 also known as B lymphocyte chemoattractant (BLC), which also lacks the ELR motif. Unlike the typical four exons structure of CXC chemokine, vIL-8 and CXCL13 have only three exons. In addition, we identified cCXCR5 as the receptor of vIL-8, which is the exclusive receptor of cCXCL13 and is present on chicken B and certain T cell subsets. To address if cCXCL13 can complement vIL-8 in MDV pathogenesis and tumor formation, I used the bacterial artificial chromosome (BAC) system harboring the sequence of the very virulent MDV (vvMDV) RB-1B strain to generate recombinant viruses that express the cellular cCXCL13s in the absence of vIL-8. First, I inserted cCXCL13L1 downstream of vIL-8, but this locus did not allow secretion of cCXCL13. Next, I inserted the three variants of cCXCL13 (L1, L2 and L3) under the control of the immediate early cytomegalovirus promoter (pCMV) in the unique long region (at the C-terminus of UL35 and UL45), these recombinant mutants were unable to replicate in vitro. We then target the non-essential mini-F locus to insert CXCL13 driven by pCMV; however, the recombinant virus of CXCL13L1 was unable to replicate in vitro. Finally, insertion of cCXCL13 in mini-F driven by Thymidine kinase promoter (TK) allows reconstitution of recombinant viruses that secreted cCXCL13 and replicated comparable to wild type virus in vitro. We conduct in vivo experiment by infect one day chicks with the recombinant viruses and keep some as contacts. The recombinant viruses were replicate slightly lower that wild type in the infected animals, but unable to tarnsmitte and replicate in contact birds. In addition, the mutants couldn’t complement the loss of vIL-8 in MDV pathogenicity. To explain the lack of complementation between vIL-8 and its cellular orthologue, I tagged vIL-8 with a polyhistidine-tag (6xHis-tag). This tagging enables comparable quantification of vIL-8 expression driven by its original promoter with TK-CXCL13 encoded in the mini-F. The results demonstrate that the expression level of vIL-8 is much higher than cCXCL13s driven by the TK promoter in mini-F, indicated that expression levels and kinetics are crucial for chemokine function.
Bei dem Virus der Marek’schen Krankheit (MDV) handelt es sich um krebserzeugendes Alphaherpesvirus welches die Marek’sche Krankheit (MD) in Hühnern auslöst. Die Infektion von Hühnern mit virulenten Stämmen des MDV führt dabei zu hoher Mortalität, vizeralen Lymphomen, Paralyse und Immunsupression. Mit diesen Symptomen der MD geht ein hoher wirtschaftlicher Verlust einher. Das Genom des MDV kodiert für ein CXC-Chemokin (ein chemotaktisches Zytokin) namens vIL-8, welches aufgrund von Sequenzübereinstimmungen nach dem Interleukin-8 des Huhnes (cCXCL8) benannt ist. Neuere Untersuchungen bezüglich der Funktion des vIL-8 zeigten jedoch, dass es sich nicht um ein cCXCL8-Homolog handelt. Daher ist die Identifikation eines zellulären vIL-8-Orthologs sowie Rezeptorbindungsstudien notwendig, um die Funktion des Proteins in der MDV Pathogenese zu verstehen. Im ersten Teil des Projektes wurde die evolutionäre Verwandtschaft des vIL-8 mit anderen Proteinen untersucht und eine funktionelle Charakterisierung in vitro vorgenommen. Phylogenetische Untersuchungen sowie Analysen der Aminosäuresequenzen von vIL-8 im Vergleich zu allen bekanten CXC-Chemokinen des Menschen und Huhns zeigten, dass es sich bei dem vIL-8 aufgrund des Fehlens eines konservierten Aminosäuresequenzmotifs (bestehend aus den Aminosäuren Glutaminsäure, Leucin und Arginin) um ein so genanntes ELR- CXCChemokin handelt. ELR+ CXC-Chemokine, wie das cCXCL8, binden an die Rezeptoren CXCR1 und CXCR2 und induziert die chemotaktische Anlockung von Heterophilen und Monozyten sowie die Angiogenese. Von allen untersuchten CXC- Chemokinen weißt vIL-8 die größte Ähnlichkeit mit cCXCL13L1 oder dem B lymphocyte chemoattractant (BLC) auf. Bei vIL-8 und cCXCL13L1 handelt es sich um ELR- CXC-Chemokine. Im Gegensatz zu der typischen Struktur von CXC- Chemokingenen mit vier Exonen, besitzen beide allerdings nur drei Exone. Unsere Untersuchungen zeigten, dass vIL-8 den cCXCR5-Rezeptor bindet (den eigentlichen Rezeptor des cCXCL13) und als chemotaktisches Zytokin für Hühner B- und TZellen, welche CXCR5 exprimieren, wirkt. Um zu untersuchen ob das zelluläre cCXCL13 das vIL-8 in der MDV-Pathogenese und Tumorentstehung funktionell ersetzen kann, erzeugten wir, basierend auf dem bacterial artificial chromosome (BAC) des hochvirulenten RB1B-Stamms, verschiedene rekombinante Virusmutanten. Um dabei die Produktion und Sekretion von vIL-8 nachzuahmen, wurde cCXCL13 in die folgenden Genombereiche eines vIL-8 negativen BACs inseriert: 1) in der 3’ Region des ursprünglichen vIL-8, in welcher extensives Splicing die Sekretion jedoch inhibierte; 2) innerhalb der UL-Region (auf die Gene UL35 and UL45 folgend), wodurch es zu einer massiven Beeinträchtigung des viralen Wachstums kam; 3) innerhalb des nichtessentiellen mini-F Lokus unter der Kontrolle des starken Promotors des Cytomegaloviruses, wodurch es ebenfalls zur Beeinträchtigung des Wachstums kam, 4) innerhalb des mini-F Lokus unter der Kontrolle des schwächeren Thymidinkinasepromotors. Diese Virusmutante ermöglichte die Sekretion des Proteins und erlaubte eine vergleichbare Replikation in vitro und in vivo. Des Weiteren zeigte sich, dass die Funktion des vIL-8 bezüglich der Pathogenese in vivo durch das cCXCL13 nicht kompensiert werden konnte. Die Gründe hierfür sind nicht bekannt, könnten jedoch mit der Position des Gens innerhalb der mini-F sowie der Kontrolle durch den fremden Promotor im Zusammenhang stehen. Um dieser Frage nachzugehen und die Sekretion des vIL-8 im Wildtypvirus zu untersuchen, wurde ein Polyhistidin-Tag (6xHis-tag) an das c-terminale Ende des Gens fusioniert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das Expression des vIL-8 unter Kontrollen des eigenen Promotors viel höher als die des cCXCL13 unter Kontrolle des TK- Promotors war. Dieser Umstand könnte erklären warum das cCXCL13 nicht in der Lage war, dass vIL-8 in der MDVPathogenese zu kompensieren.
