Das humane Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein 42 nm großes partiell doppelsträngiges DNA-Virus, das der Familie der Hepadnaviridae zugeordnet wird [Modrow et al., 2010]. Infektionen mit HBV können akute und chronische Leberentzündungen hervorrufen und gelten als einer Hauptrisikofaktiren für hepatozelluläre Karzinome (HCC), welche die häufigste Form der malignen Lebertumoren darstellen [Schaedler et al., 2010]. Eine verminderte Leberregeneration begünstigt hierbei die Entstehung einer Leberfibrose beziehungsweise -zirrhose und führt zu einem Verlust von funktionellem Leberparenchym [Lok and McMahon, 2007]. Ein wichtiger regulatorischer Faktor für die Leberregeneration ist der Transkriptionsfaktor nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2). Dieser bindet an die antioxidant response elements (ARE)-Region verschiedener Gene und kontrolliert so die Expression von Proteinen, die für Detoxifikation und Elimination von Elektrophilen und ROS zuständig sind und liegt vermehrt in HBV-positiven Zellen vor [Nguyen et al., 2009, Schaedler et al., 2010]. Darüber hinaus konnte in Nrf2-knock-out-Mäusen nach partieller Hepatektomie eine verminderte Leberregeneration beobachtet werden. Dies ist durch einen erhöhten ROS-Spiegel bedingt, der zu einer Hemmung der insulinab- hängigen Signaltransduktion führt [Beyer et al., 2008]. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des HBV auf die Insulin-/IGF-1-Signalkaskade und der Einfluss von Nrf2 auf die Leberregeneration in HBV-positiven Zellen untersucht werden. Zunächst wurde die Mengen wichtiger Proteine der Insulin-Signalkaskade im Western Blot analysiert. Diese zeigten, dass in HBV-replizierenden Zellen eine signifikant höhere Menge an Insulin-Rezeptor enthalten ist, wohingegen weder die Menge des Insulin-like-growth-factor-Rezeptor (IGF-Rezeptors) noch des Insulinrezeptor- Substrats-1 (IRS-1) verändert ist (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.1, Abbildung 5.5 und Abbildung 5.6). Die höhere Expression des Insulin-Rezeptors wurde anschließend in transient transfizierten HBV-replizierenden Zelllinien durch Immunfluoreszenzuntersuchungen bestätigt. Der Rezeptor scheint jedoch internalisiert und nicht plasmamembranassoziiert vorzuliegen (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.2). Da auch die IR-mRNA-Mengen in HBV-replizierenden Zellen erhöht sind, kann von einer heraufgesetzten Expression und nicht von einer verminderten Rezeptordegradation ausgegangen werden (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.3). Eine der möglichen Erklärungen hierfür wäre eine Insulin- Rezeptor-Retention durch α-Taxilin, welches den intrazellulären Vesikeltransport inhibiert und in HBV-replizierenden Zellen in erhöhter Menge vorliegt [Hoffmann et al., 2013]. Aufgrund der erhöhten IR-Menge in HBV- replizierenden Zellen in vitro wurden diese Ergebnisse auch in in vivo verifiziert, sowohl durch Verwendung von HBV-transgenen Mäusen als auch durch Leberschnitte von HBV-infizierten Patienten (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.4 und Kapitel 5.3.1, Abbildung 5.17). Um mehr Informationen über die Aktivierung des Insulin-/IGF-1-Signalweges zu bekommen, wur- den anschließend stabil HBV- replizierende Hepatoblastomzellen und Kontrollzellen mit Insulin und Glukoseoxidase stimuliert, um kontinuierlichen ROS durch Wasserstoffperoxid zu erzeugen (siehe Kapitel 6, Abbildung 6.1). Die Daten bestätigen, dass der Insulin-/IGF-1-Signalweg auf der Rezep- torebene sowohl in HBV-positiven als auch in HBV-negativen Zellen normal aktiviert wird. Die Aktivierung in HBV- replizierenden Zellen ist sogar höher als die in negativen Zellen, wenn gleichzeitig mit Insulin und Glukoseoxidase stimuliert wird (siehe Kapitel 5.2.1, Abbildung 5.10). Da HBV eine Aktivierung der Nrf2-/ARE-abhängig regulierter Gene bewirkt, könnte dies ein Mechanismus sein, um das Überleben der infizierten Zellen zu sichern, die Immunantwort zu modifizieren und somit die Infektion zu manifestieren [Schaedler et al., 2010]. Eine Studie mit Nrf2 -knockout-Mäusen konnte zeigen, dass die Phosphorylierung von IRS-1 an Tyrosin als Folge einer Insulinstimulation deutlich vermindert war nach partieller Hepatektomie. Dies scheint der Grund für eine Insulinresistenz in Nrf2 -knockout-Hepatozyten zu sein, da die IR-Phoyphorylierung normal war [Beyer and Werner, 2008, Beyer et al., 2008]. Die Phosphorylierung von IRS-1 an Serin in HepAD38 und HepG2.2.15, welche mit Glukoseoxidase stimuliert wurden, ist deutlich vermindert verglichen mit HBV-negativen Zellen (siehe Kapitel 5.2.2, Abbildung 5.12). Dies zeigt einmal mehr, dass HBV-positive Zellen verglichen mit HBV-negativen Zellen weniger durch ROS beeinträchtigt werden. Die Aktivität von JNK als ein Mediator der Insulinresistenz durch Phosphorylierung von IRS-1 an Serin ist reduziert in HBV-replizierenden Zellen, obwohl mehr p -IRS-Ser vorliegt (siehe Kapitel 5.2.2, Abbildung 5.12 und Kapitel 5.2.3, Abbildung 5.14) [Beyer et al., 2008]. Dies bestärkt die Vermutung, dass mindestens eine weitere Kinase neben JNK die Phosphorylierung an IRS reguliert. Zusammenfassend konnte in HBV-replizierenden Zellen gezeigt werden, dass erhöhte ROS-Level nicht die Aktivierung des Insulin-/IGF-1-Signalweges beeinträchtigen. Jedoch könnte ROS durch das Immunsystem vor allem durch zytotoxische T-Zellen deutlich ausgeprägter in vivo sein. Uner- warteterweise weisen HBV-positive Zellen deutlich höhere Mengen des Insulin-Rezeptors auf, die jedoch internalisiert vorliegen. In zukünftigen Exerimenten sollte untersucht werden, ob der Rezeptor wirklich normal zur Zellmembran transportiert wird oder dieser internalisiert akkumuliert und eventuell doch zu reduzierter Insulinbindung führt. In Nrf2-knockout Mäusen kommt es nach partieller Hepatektomie zu einer verzögerten Leberregenera- tion [Beyer et al., 2008]. Deshalb war es überaus interessant zu untersuchen, ob die Leberregeneration in HBV-transgenen Mäusen ebenfalls reduziert ist im Vergleich zu C57BL/6-Kontrolltieren. Es konnte gezeigt werden, dass weibliche HBV-transgene Mäuse eine reduzierte und männliche HBV-transgene Mäuse eine verzögerte Leberregeneration verglichen zu C57BL/6-Kontrolltieren aufweisen (siehe Kapitel 5.3.4, Abbildung 5.23). Zusätzlich wurden die beiden Transaminasen ALT und AST im Serum nach Hepatektomie bestimmt, um den aufgetretenen Leberschaden zu ermitteln (siehe Kapitel 5.3.5, Abbildung 5.24 und 5.25). Die zunächst erhöhten AST- und ALT-Werte nach Hepatektomie lassen sich vor allem auf die chirurgische Intervention zurückführen und nicht auf eine erhöhte Apoptose. Um dies zu bestätigen, wurden zusätzlich ein TUNEL- Assay und ein cleaved-PARP-ELISA durchgeführt. Zusammenfassend zeigen diese in vivo-Daten, dass eine beieinträchtigte Regeneration vorliegt, hierbei scheint sich jedoch um einen von Nrf2 unabhängigen Prozess zu handeln, da HBV die Expression der Nrf2-/ARE-regulierten Proteine induziert [Schaedler et al., 2010]. In weiteren Experimenten sollte der Probenumfang erhöht werden und es wäre interessant zu wissen, ob die BrdU-positiven Zellen HBV-positive oder negative Zellen sind. So könnte festgestellt werden, ob beide Zellen gleichermaßen auf den Regenerationsreiz der Hepatektomie reagieren. Darüber hinaus wäre es interessant zu wissen, ob eine unterschiedliche Regeneration nach CCl4-induzierter Leberschädigung erfolgt.
The human hepatitis B virus (HBV) is a 42nm partially double-stranded DNA- virus belonging to the familiy of hepadnaviridae [Modrow et al., 2010]. Infection with HBV can cause acute or chronic inflammation of the liver and is considered to be a major etiological factor in the development of human hepatocellular carcinoma (HCC) [Schaedler et al., 2010]. A decreased level of liver regeneration promotes the development of fibrosis and liver cirrhosis leading to a loss of liver function [Lok and McMahon, 2007]. An important regulatory factor for the control of liver regeneration is the transcription factor nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2). Nrf2 binds to antioxidant response elements (ARE) and thereby triggers the expression of cytoprotective proteins [Nguyen et al., 2009, Schaedler et al., 2010]. This factor regulates the expression of antioxidant proteins important for reactive oxygen stress (ROS) detoxification and is upregulated in HBV-positive cells [Schaedler et al., 2010]. Recently, it was shown that Nrf2-deficient mice show an impaired liver regeneration due to an elevated ROS level that results in insulin and IGF resistance [Beyer et al., 2008]. In this study, the interference between HBV and insulin-dependent signaling pathways should be investigated in more detail to characterize the influence of Nrf2 on liver regeneration in HBV- positive cells. First of all, Western-Blot-analyses, investigating the amount of key proteins of the insulin signaling pathway, showed that the level of insulin receptor in HBV-positive cells is significantly increased, whereas the insulin like growth factor receptor (IGF-1R) and the insulin receptor substrates (IRS) are not affected (see chapter 5.1, fig. 5.1, fig. 5.5 and fig. 5.6). This was confirmed by analyzing transiently transfected cells by confocal immunofluorescence microscopy. The transiently transfected cells revealed higher IR amounts compared to HBV-negative controls, but the receptor seemed to be internalized instead of plasmamembrane-associated (see chapter 5.1, fig. 5.2). Since IR-mRNA levels are increased in HBV-replicating cells, it is to be assumed that elevated IR levels are due to increased expression and not to decreased receptor degradation (see chapter 5.1, fig. 5.3). A possible explanation could be an insulin receptor retention by α-taxilin, which is increased in HBV replicating cells, inhibiting the intracellular vesicular trafficking [Hoffmann et al., 2013]. Based on the higher IR amounts in HBV-positive cells in vitro, this data were also verified in in vivo models including both, HBV-transgenic mice and livers of HBV-infected patients (see chapter 5.1, fig. 5.4 and chapter 5.3.1, fig. 5.17).In order to get more information about the activation of the insulin signaling pathway, stable HBV- expressing and HBV-negative control cells were stimulated with insulin and glucose oxidase to initiate continuous ROS via hydrogen peroxide (see chapter 6, fig. 6.1). The data confirm that the insulin signaling pathway is activated at the level of the insulin receptor in HBV-positive as well as in HBV- negative cells. Activation in HBV-positive cells is even higher if stimulated simultaneously with insulin and glucose oxidase (see chapter 5.2.1, fig. 5.10). As HBV induces a strong activation of Nrf2-/ARE-regulated genes, this might ensure survival of the infected cell, shape the immune response to HBV and thereby promotes the establishment of the infection [Schaedler et al., 2010]. A recent study in Nrf2-deficient mice showed that tyrosine phosphorylation of the IRS-1 and PI3K activation in response to insulin was inhibited in the regenerating liver after partial hepatectomy. This is most likely responsible for the insulin/IGF-1 resistance in Nrf2-deficient hepatocytes, since IR phosphorylation occurred normally [Beyer and Werner, 2008, Beyer et al., 2008]. Serine phosphorylation of IRS in glucose oxidase- treated HepAD38 and HepG2.2.15 is decreased compared to HBV-negative cells (see chapter 5.2.2, fig. 5.12). Once more this claims a minor impairment of the insulin signaling pathway in HBV-positive cells by ROS compared to HBV- negative cells. JNK is a mediator of insulin resistance by phosphorylating IRS-1 at serin and thereby inhibiting its phosphorylation at tyrosine [Beyer et al., 2008]. However, in HBV-replicating cells the activity of JNK is reduced and there is an increased amount of p-IRS-Ser (see chapter 5.2.2, fig. 5.12 and chapter 5.2.3, fig. 5.14). This indicates that another kinase besides JNK regulates IRS phosphorylation as well. In summary, HBV induces the expression of ARE-regulated genes by activation of Nrf2 [Schaedler et al., 2010]. However, increased ROS-level in chronic HBV-infections do not impair the insulin/IGF-pathway. Nevertheless, ROS induced by an immune response especially by cytotoxic T-cells might be more pronounced in vivo. Unexpectedly, it could be shown that HBV expressing cells possess increased amounts of insulin-receptors. In future experiments, it should be investigated whether the receptor is properly translocated to the cell membrane or accumulates intracellularly leading to reduced insulin binding. Nrf2-deficient mice showed a delayed liver regeneration after partial hepatectomy [Beyer et al., 2008]. Therefore, it was tempting to analyze whether liver regeneration is impaired in HBV transgenic mice as well. It was found that female HBV transgenic mice have a reduced and male HBV transgenic mice have a delayed liver regeneration compared to wild type mice (see chapter 5.3.4, fig. 5.23). In addition, serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase were analyzed to determine liver damage after hepatectomy (see chapter 5.3.5, fig. 5.24 and 5.25). Nevertheless, increased level of serum transferases after hepatectomy due to the surgical intervention and not to apoptosis. This was confirmed by a TUNEL Assay and a cleaved PARP ELISA. Taken together, these results indicate that impaired liver regeneration seems to be independent of Nrf2, since HBV induces expression of Nrf2-/ARE-regulated Proteins [Schaedler et al., 2010]. In future experiments, it could be investigated whether the BrdU-positive cells are HBV-positive or -negative cells and whether they respond equally to hepatectomy. Moreover, it would be interesting to see if a different regeneration of liver damage occurs after carbon tetrachloride (CCl4) treatment.
