Einleitung: Lipoxygenasen (LOXn) sind Lipid-peroxidierende Enzyme, die bisher in zwei (Bakterien, Eukaryonten) der drei Domänen des irdischen Lebens nachgewiesen wurden. Diese Enzyme kommen bei höheren Pflanzen und Säugetieren weit verbreitet vor und sind dort an der Regulation von Reifungs- und Differenzierungsprozessen sowie an der Biosynthese verschiedener Lipidmediatoren beteiligt. In niederen Organismen kommen LOXn weniger weit verbreitet vor, und in Bakterien gibt es nur vereinzelt funktionelle LOXn. Echte virale LOXn wurden in der Literatur bislang noch nicht beschrieben. Da Viren die am weitesten verbreitete biologische Erscheinungsform auf der Erde darstellen und da sie als Vektoren für den horizontalen Gentransfer bedeutsam sind, sollte in der vorliegenden Arbeit geklärt werden, ob und in welcher Häufigkeit LOX-ähnliche Sequenzen in Viren vorkommen und ob virale LOX-ähnliche Sequenzen für funktionelle LOX-Isoformen kodieren. Methoden: Um diese Fragen zu beantworten, durchsuchten wir mit einer mehrstufigen sequenzbasierten Screeningstrategie die NCBI Datenbank viraler Genomsequenzen auf das Vorkommen potentieller LOX-Gene. Dabei wurde eine potentielle LOX-Sequenz im Genom eines Mimivirus entdeckt, das die Amöbe Acanthamoeba polyphaga infiziert. Diese Sequenz zeigt zwar nur eine ca. 15 %-ige Aminosäureidentität mit verschiedenen pro- und eukaryontischen LOXn, enthält aber wie alle anderen bisher identifizierten LOXn zwei potentielle Eisenbindungskluster. Ergebnisse: Diese potentielle virale LOX wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit rekombinant exprimiert, gereinigt und hinsichtlich ihrer protein-chemischen und enzymatischen Eigenschaften charakterisiert. Immunoblotanalysen und LC-MS-Daten der tryptischen Verdauungspeptide bestätigten die chemische Indentität des rekombinanten Proteins, doch LOX-Aktivitätsassays mit verschiedenen Substratfettsäuren lieferten keinen Hinweis auf eine LOX-Aktivität. Weiterhin deuten die Ergebnisse der Metallanalyse (Eisen, Mangan) der gereinigten Enzympräparation darauf hin, dass es sich bei dem rekombinant exprimierten Protein nicht um eine katalytisch aktive LOX handelt. Bei der affinitätschromatographischen Reinigung der potentiellen Mimivirus-LOX fiel auf, dass das rekombinante His-tag Fusionsprotein einen heterodimeren Komplex mit einem E. coli-Protein bildet, welches als das bifunctionelle Polymyxinresistenzprotein ArnA identifiziert werden konnte. Dieses Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Biosynthese des Lipids A, das ein wichtiger Strukturbestandteil des bakteriellen Lipopolysaccharids LPS ist. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse unserer Suchstrategie nach LOX-ähnlichen Sequenzen in den Genomen der bisher sequenzierten Viren deuten darauf hin, dass funktionelle LOX-Gene bei Viren nicht bzw. nur wenig verbreitet vorkommen. Die einzige virale LOX-ähnliche Sequenz, die mit Hilfe der von uns entwickelten Screeningstrategie identifiziert werden konnte, kodiert nicht für eine funktionelle LOX. Diese Daten unterstützen die früher gezogene Schlussfolgerung, dass funktionelle LOXn in humanpathogenen Viren nicht vorkommen, sodass kein Zusammenhang zwischen viralen LOXn und Virus-induzierten Infektionskrankheiten hergestellt werden kann.
Introduction: Lipoxygenases (LOXs) are lipid peroxidizing enzymes, which have been detected in two (bacteria, eucarya) of the three domains of terrestrial life. They frequently occur in higher plants and mammals and have been implicated in cell differentiation and maturation but also in the biosynthesis of lipid mediators. In lower organisms they only occur at low frequency and in bacteria these enzymes rarely occur. Since viruses represent the most abundant type of biological entity on earth and since they frequently function as vectors for horizontal gene transfer we aimed at exploring whether LOX-like sequences occur in viral genomes and whether such sequences might encode for functional LOX enzymes. Methods: To answer these questions, we used a multistep sequence-based screening strategy to screen the NCBI database of viral genome sequences for the presence of potential LOX genes. We identified a single potential LOX-like sequence in the genome of a mimivirus that frequently infects the amoeba Acantamoeba polyphaga. This sequence only shared a low (15 %) degree of amino acid conservation with different mammalian lipoxygenase isoforms. However, as eukaryotic LOXs this protein involved two putative metal ligand clusters in appropriate distance to each other. Results: The potential LOX-like sequence of Acantamoeba polyphaga was expressed as N-terminal hexa-his-tag fusion protein in E. coli and was purified from the bacterial lysate supernatant. The chemical identity of the recombinant protein was confirmed by immunoblotting using an anti-his-tag antibody and by LC-MS analyisis of the tryptic digest fragments. Unfortunately, the recombinant protein did neither contain iron nor manganese, which are essential for the catalytic cycle of LOXs. Moreover, activity assays with different polyenoic fatty acids did not reveal any evidence for a fatty acid oxygenase activity. Interestingly, the recombinant protein formed a non-covalent dimer with the bifunctional polymyxin resistance protein ArnA, which was co-purified with the his-tag fusion protein by affinity chromatography. This enzyme has previously been implicated in the biosynthesis of lipid A, which is a functionally relevant constituent of the bacterial lipopolysaccharide LPS. Conclusions: Our data suggest that the LOX-like sequence present in the genome of the Acantamoeba polyphaga mimivirus does not encode for a functional LOX-isoform. Moreover, the negative outcome of our searching strategy for LOX-like sequences in viral genomes and the lack of such sequences in a large number of human pathogenic viruses strongly suggest that LOXs do not frequently occur in viruses and that LOX may not be related to viral pathogenicity
