Influenza virus is a contagious pathogen of multiple hosts, including humans, other mammals and avian species. In humans and other mammalian hosts viruses usually infect the respiratory epithelium and are airborne transmitted. In contrast, in birds it also infects the intestinal tract and transmits primarily via the fecal-oral route. The major glycoprotein hemagglutinin (HA) of Influenza virus plays a vital role in receptor binding and subsequent fusion of the viral with a host membrane. Proteolytic processing of HA into HA1 and HA2 subunits by trypsin-like proteases and an irreversible conformational change induced by acidic pH are required for membrane fusion. However, acidic pH (as it prevails in the gizzard of birds) inactivates virus particles and high concentrations of trypsin as well as other digestive proteases, such as pepsin and chymotrypsin proteolytically digest HA. In this study, I mimicked the passage of viruses through the gastrointestinal tract by incubating two avian Influenza strains with gizzard and gut fluid from chicken and determined virus titers and integrity of HA by western-blot. The gizzard fluid completely inactivated virions and degrades HA even at a high dilution, but only if the pH was kept acidic. If the fluid is diluted with neutral buffer (mimicking virus uptake with seawater) particles were more resistant. Virions containing an uncleaved HA were even activated suggesting that gastric juice contains a trypsin-like protease. Undiluted intestinal fluid inactivated particles and destroyed HA, but diluted fluid activated virions. Thus, under certain conditions Influenza viruses can withstand the destructive fluids of the avian digestive tract. A remarkable difference exists in this regard between the fowl plaque virus (FPV M1) and a virus isolated from the duck ́s intestine (A/duck/Bavaria/77). While FPV M1 requires a high dilution of 1:1000 to be activated, lower dilutions inactivated the virus and degraded HA. In contrast; the duck-derived virus is already activated at a dilution of 1:10. Thus, the duck-derived virus is more tolerant against intestinal fluid compared to fowl plaque virus suggesting that the former is better adapted to grow in the intestine of birds. Hitherto, no cell lines from the intestine of birds were available. Here I tested a novel chicken intestinal epithelial cell line, which we obtained from the company “MicroMol”. The cell lines show typical epithelial morphology and do not exhibit any sign of senescence during repeated passage. The cell lines are permissive to five Influenza A viruses (two of avian origin and three of human origin), one Influenza B virus, one Influenza C virus and a velogenic Newcastle Disease Virus strain. These cells effectively process HA with a polybasic cleavage site, probably by the cellular protease furin. In contrast, exogenous trypsin is required in multiple step growth experiments, indicating that viruses with a monobasic HA cleavage site are not activated. Thus, these cells have identical properties as any other known cell line that is susceptible to Influenza infection.
Das Influenzavirus ist ein ansteckender Erreger mehrerer Wirte, einschließlich Menschen, anderer Säugetiere und Vogelarten. Bei Menschen und anderen Säugetieren infizieren Viren normalerweise das respiratorische Epithel und werden über die Luft übertragen. Im Gegensatz dazu infiziert es bei Vögeln auch den Intestinaltrakt und überträgt sich hauptsächlich über den fäkal-oralen Weg. Das Glykoprotein Hämagglutinin (HA) des Influenza-Virus spielt eine entscheidende Rolle bei der Rezeptorbindung und der anschließenden Fusion des Virus mit einer Wirtsmembran. Die proteolytische Prozessierung von HA in die HA1- und HA2-Untereinheiten durch Trypsin-ähnliche Proteasen und eine irreversible Konformationsänderung, induziert durch den sauren pH-Wert, sind für die Membranfusion erforderlich. Ein saurer pH-Wert (wie er im Muskelmagen von Vögeln vorherrscht) inaktiviert jedoch Viruspartikel und eine hohe Konzentration an Trypsin sowie anderen Verdauungsproteasen, wie Pepsin und Chymotrypsin, verdaut HA proteolytisch. In dieser Studie ahmte ich die Passage von Viren durch den Magen-Darm-Trakt nach, indem ich zwei Vogelgrippestämme mit Muskelmagen- und Darmflüssigkeit von Hühnern inkubierte und die Virustiter und die Integrität von HA mittels Western-Blot bestimmte. Die Muskelmagenflüssigkeit inaktivierte Viren vollständig und degradierte HA selbst bei einer hohen Verdünnung, jedoch nur, wenn der pH-Wert sauer gehalten wurde. Wenn die Flüssigkeit mit neutralem Puffer verdünnt wird (was die die Virusaufnahme mit Seewasser imitiert), sind die Partikel widerstandsfähiger. Viren, die ungespaltenes HA enthielten, wurden sogar aktiviert, was darauf hindeutet, dass Magensaft eine Trypsin-ähnliche Protease enthält. Unverdünnte Darmflüssigkeit inaktivierte Viruspartikel und zerstörte HA, aber verdünnte Flüssigkeit aktivierte diese Viren. Somit können Influenzaviren unter bestimmten Bedingungen den zerstörerischen Flüssigkeiten des aviären Verdauungstrakts widerstehen. In dieser Hinsicht besteht ein bemerkenswerter Unterschied zwischen einer Mutante des Geflügelpestvirus (FPV M1) und einem aus Entendarm isolierten Virus (A/duck/Bavaria/77). Während FPV M1 eine hohe Verdünnung von 1: 1000 erfordert, um aktiviert zu werden, inaktivieren niedrigere Verdünnungen das Virus und degradieren HA. Im Gegensatz dazu wird das von Enten stammende Virus bereits bei einer Verdünnung von 1:10 aktiviert. Daher ist das Entenvirus gegenüber Darmflüssigkeit toleranter als das Geflügelpestvirus, was darauf hindeutet, dass ersteres besser für das Wachstum im Darm von Vögeln geeignet ist. Bisher waren keine Zelllinien aus dem Darm von Vögeln verfügbar. Hier habe ich eine neue Hühnerdarmepithelzelllinie getestet, die wir von der Firma „MicroMol“ bezogen haben. Die Zelllinien besitzen eine typisch epitheliale Morphologie und zeigen bei wiederholter Passage keine Anzeichen von Seneszenz. Die Zelllinien sind permissiv für fünf Influenza-A-Viren (zwei aviären Ursprungs und drei humanen Ursprungs), ein Influenza-B-Virus, ein Influenza-C-Virus und einen velogenen Newcastle-Disease-Virus-Stamm. Diese Zellen prozessieren HA mit einer polybasischen Schnittstelle effektiv, wahrscheinlich durch die zelluläre Protease Furin. Im Gegensatz dazu wird in mehrstufigen Wachstumsexperimenten exogenes Trypsin benötigt, was darauf hinweist, dass Viren mit einer monobasischen HA-Schnittstelle nicht aktiviert werden. Somit haben diese Zellen die gleichen Eigenschaften wie jede andere bekannte Zelllinie, die für eine Influenza-Infektion anfällig ist.
