Marek’s disease virus (MDV) is a strictly cell-associated herpesvirus that is deadly and oncogenic in its natural host with up to 100% mortalities in unvaccinated flocks. In addition to the economic and agriculture importance, it is a natural virus-host model for the investigation of virus-induced lymphomas. Lymphomas are the main cause of MDV-induced tremendous suffering and death in chickens. MDV harbours a linear double-stranded genome of about 180-kilobase pairs composed of two unique regions, unique long (UL) and unique short (US). Unique regions are flanked by further repeats that have a set of genes that contributes to MDV pathogenicity and oncogenicity. These genes are the major oncogene meq, the open reading frames (ORF) RLORF5a and RLORF4, and the chemokine homolog vIL-8. Moreover, these genes encode a set of splice variants that are thought to contribute to MDV pathogenesis and carcinogenesis. Yet it is unclear if all or some of these splice variants encode an expressed protein. Interestingly, these variants are spliced to the vIL-8 gene that consists of three exons and two introns. Introns are non-coding sequences and yet their significance is underappreciated or poorly understood, despite they include important junctions that mediate splicing. In this study, one or all introns of vIL-8 were removed to abrogate the splicing of vIL-8 and characterize the importance of introns for virus replication and protein secretion. Interestingly, vIL-8 introns were non-essential for virus replication, but they were indispensable for protein secretion. In addition, intron II was found to harbour a novel exon (E3`) that is spliced to express novel vIL-8 protein variants that were non-essential for virus replication or protein secretion. This study is the first to report that alphaherpesviruses express novel chemokine variants and lay the foundation for future studies to dissect the role of vIL-8 splice variants in MDV pathogenesis and tumour formation. CRISPR/Cas was discovered in bacteria and archaea as an adaptive antiviral immune mechanism. Streptococcus pyogenes have evolved CRISPR/Cas9, which is the best-studied example of the CRISPR/Cas systems until now. CRISPR/Cas9 has been recently used in various applications that revolutionized the basic molecular biology. In principle, guide RNAs recruit Cas9 to cleave the targets in a very precise manner. In this study, CRISPR/Cas9 was used to target MDV essential genes to inhibit virus replication. Interestingly, while single gRNAs significantly impaired virus replication to different degrees, multiple gRNAs completely inhibited MDV replication. Moreover, CRISPR/Cas9 was tested for the long-term elimination of MDV from infected cultures that were serially passaged. Intriguingly, the single guides showed MDV escape mutants that appeared very quickly, yet the combined gRNAs did not produce MDV that is able to evade CRISPR/Cas9. Sequencing of the escape mutants revealed specific mutations that were seen in the recognition sites of two MDV single gRNAs, which would eliminate their ability to functionally cleave the mutated MDV targets. In all, this is the first demonstration that CRISPR/Cas9 can inhibit MDV replication and evasion, especially when two or more gRNAs are used. This study provides the basis for future studies to protect chickens from this deadly oncogenic herpesvirus.
Das Virus der Marek‘schen Krankheit (Marek’s Disease Virus, MDV) ist ein strikt zellassoziiertes Herpesvirus, das in seinem natürlichen Wirt tödlich und onkogen wirkt und bei ungeimpften Herden eine Sterblichkeit von bis zu 100 % aufweist. Neben der wirtschaftlichen und landwirtschaftlichen Bedeutung ist es ein natürliches Virus-Wirt-Modell für die Untersuchung von virusinduzierten Lymphomen. Lymphome sind die Hauptursache für MDV-induziertes enormes Leiden und Sterben bei Hühnern. MDV beherbergt ein lineares doppelsträngiges Genom mit etwa 180 Kilobasenpaaren, bestehend aus zwei einzigartigen Regionen zusammensetzt, der einzigartigen langen (UL) und der einzigartigen kurzen (US). Die einzigartigen Regionen werden von weiteren Wiederholungen flankiert, die einen Satz von Genen aufweisen, der zur Pathogenität und Onkogenität des MDV beiträgt. Diese Gene sind das Hauptonkogen meq, die offenen Leseraster (ORF) RLORF5a und RLORF4 und das Chemokin-Homolog vIL-8. Darüber hinaus kodieren diese Gene für eine Reihe von Spleißvarianten, von denen angenommen wird, dass sie zur MDV-Pathogenese und Karzinogenese beitragen. Es ist jedoch unklar, ob alle oder einige dieser Spleißvarianten für ein exprimiertes Protein kodieren. Interessanterweise sind diese Varianten an das vIL-8-Gen gespleißt, das aus drei Exons und zwei Introns besteht. Introns sind nicht-kodierende Sequenzen und dennoch wird ihre Bedeutung unterschätzt oder schlecht verstanden, obwohl sie wichtige Knotenpunkte enthalten, die das Spleißen vermitteln. In dieser Studie wurden ein oder alle Introns von vIL-8 entfernt, um das Spleißen von vIL-8 aufzuheben und die Bedeutung der Introns für die Virusreplikation und die Proteinsekretion zu charakterisieren. Interessanterweise waren vIL-8-Introns für die Virusreplikation nicht essentiell, aber für die Proteinsekretion waren sie jedoch unverzichtbar. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Intron II ein neues Exon (E3`) beherbergt, das gespleißt wird, um neue vIL-8-Proteinvarianten zu exprimieren, die für die Virusreplikation oder Proteinsekretion nicht essentiell waren. Diese Studie ist die erste, in der berichtet wird, dass Alphaherpesviren neuen Chemokin-Varianten exprimieren, und sie bildet die Grundlage für zukünftige Studien zur Aufklärung der Rolle von vIL-8-Spleißvarianten in der MDV-Pathogenese und Tumorbildung. CRISPR/Cas wurde bei Bakterien und Archaeen als ein adaptiver antiviraler Immunmechanismus entdeckt. Streptokokken-Pyogene haben CRISPR/Cas9 entwickelt, welches das bisher am besten untersuchten Beispiel für das CRISPR/Cas-System ist. CRISPR/Cas9 wurde kürzlich in verschiedenen Anwendungen eingesetzt, welche die grundlegende Molekularbiologie revolutioniert haben. Im Prinzip rekrutieren Leit-RNAs Cas9, um die Zielobjekte auf sehr präzise Weise zu spalten. In dieser Studie wurde CRISPR/Cas9 verwendet, um MDV-wichtige Gene anzuvisieren und die Virusreplikation zu hemmen. Interessanterweise beeinträchtigten einzelne gRNAs die Virusreplikation in unterschiedlichem Ausmaß, aber mehrere gRNAs die MDV-Replikation vollständig inhibierten. Darüber hinaus wurde CRISPR/Cas9 für die langfristige Eliminierung von MDV aus infizierten Kulturen getestet, die seriell passagiert wurden. Interessanterweise zeigten die einzelnen gRNAs MDV-Fluchtmutanten, die sehr schnell auftraten, doch die kombinierten gRNAs produzierten kein MDV, das CRISPR/Cas9 ausweichen kann. Die Sequenzierung der Fluchtmutanten offenbarte spezifische Mutationen, die in den Erkennungsstellen von zwei MDV-Einzel-gRNAs gesehen wurden, was ihre Fähigkeit, die mutierten MDV-Ziele funktionell zu spalten, eliminieren würde. Alles in allem ist dies der erste Nachweis, dass CRISPR/Cas9 die MDV-Replikation und -Evasion hemmen kann, insbesondere wenn zwei oder mehr gRNAs verwendet werden. Diese Studie bildet die Grundlage für künftige Studien zum Schutz von Hühnern vor diesem tödlichen onkogenen Herpesvirus.
