María de Jesús Arias Andrés

• Plastic pollution is ubiquitous on the planet since several millions of tons of plastic waste enter aquatic ecosystems each year. Furthermore, the amount of plastic produced is expected to increase exponentially shortly. The heterogeneity of materials, additives and physical characteristics of plastics are typical of these emerging contaminants and affect their environmental fate in marine and freshwaters. Consequently, plastics can be found in the water column, sediments or littoral habitats of all aquatic ecosystems. Most of this plastic debris will fragment as a product of physical, chemical and biological forces, producing particles of small size. These particles (< 5mm) are known as “microplastics” (MP). Given their high surface-to-volume ratio, MP stimulate biofouling and the formation of biofilms in aquatic systems. As a result of their unique structure and composition, the microbial communities in MP biofilms are referred to as the “Plastisphere.” While there is increasing data regarding the distinctive composition andPlastic pollution is ubiquitous on the planet since several millions of tons of plastic waste enter aquatic ecosystems each year. Furthermore, the amount of plastic produced is expected to increase exponentially shortly. The heterogeneity of materials, additives and physical characteristics of plastics are typical of these emerging contaminants and affect their environmental fate in marine and freshwaters. Consequently, plastics can be found in the water column, sediments or littoral habitats of all aquatic ecosystems. Most of this plastic debris will fragment as a product of physical, chemical and biological forces, producing particles of small size. These particles (< 5mm) are known as “microplastics” (MP). Given their high surface-to-volume ratio, MP stimulate biofouling and the formation of biofilms in aquatic systems. As a result of their unique structure and composition, the microbial communities in MP biofilms are referred to as the “Plastisphere.” While there is increasing data regarding the distinctive composition and structure of the microbial communities that form part of the plastisphere, scarce information exists regarding the activity of microorganisms in MP biofilms. This surface-attached lifestyle is often associated with the increase in horizontal gene transfer (HGT) among bacteria. Therefore, this type of microbial activity represents a relevant function worth to be analyzed in MP biofilms. The horizontal exchange of mobile genetic elements (MGEs) is an essential feature of bacteria. It accounts for the rapid evolution of these prokaryotes and their adaptation to a wide variety of environments. The process of HGT is also crucial for spreading antibiotic resistance and for the evolution of pathogens, as many MGEs are known to contain antibiotic resistance genes (ARGs) and genetic determinants of pathogenicity. In general, the research presented in this Ph.D. thesis focuses on the analysis of HGT and heterotrophic activity in MP biofilms in aquatic ecosystems. The primary objective was to analyze the potential of gene exchange between MP bacterial communities vs. that of the surrounding water, including bacteria from natural aggregates. Moreover, the thesis addressed the potential of MP biofilms for the proliferation of biohazardous bacteria and MGEs from wastewater treatment plants (WWTPs) and associated with antibiotic resistance. Finally, it seeks to prove if the physiological profile of MP biofilms under different limnological conditions is divergent from that of the water communities. Accordingly, the thesis is composed of three independent studies published in peer-reviewed journals. The two laboratory studies were performed using both model and environmental microbial communities. In the field experiment, natural communities from freshwater ecosystems were examined. In Chapter I, the inflow of treated wastewater into a temperate lake was simulated with a concentration gradient of MP particles. The effects of MP on the microbial community structure and the occurrence of integrase 1 (int 1) were followed. The int 1 is a marker associated with mobile genetic elements and known as a proxy for anthropogenic effects on the spread of antimicrobial resistance genes. During the experiment, the abundance of int1 increased in the plastisphere with increasing MP particle concentration, but not in the surrounding water. In addition, the microbial community on MP was more similar to the original wastewater community with increasing microplastic concentrations. Our results show that microplastic particles indeed promote persistence of standard indicators of microbial anthropogenic pollution in natural waters. In Chapter II, the experiments aimed to compare the permissiveness of aquatic bacteria towards model antibiotic resistance plasmid pKJK5, between communities that form biofilms on MP vs. those that are free-living. The frequency of plasmid transfer in bacteria associated with MP was higher when compared to bacteria that are free-living or in natural aggregates. Moreover, comparison increased gene exchange occurred in a broad range of phylogenetically-diverse bacteria. The results indicate a different activity of HGT in MP biofilms, which could affect the ecology of aquatic microbial communities on a global scale and the spread of antibiotic resistance. Finally, in Chapter III, physiological measurements were performed to assess whether microorganisms on MP had a different functional diversity from those in water. General heterotrophic activity such as oxygen consumption was compared in microcosm assays with and without MP, while diversity and richness of heterotrophic activities were calculated by using Biolog® EcoPlates. Three lakes with different nutrient statuses presented differences in MP-associated biomass build up. Functional diversity profiles of MP biofilms in all lakes differed from those of the communities in the surrounding water, but only in the oligo-mesotrophic lake MP biofilms had a higher functional richness compared to the ambient water. The results support that MP surfaces act as new niches for aquatic microorganisms and can affect global carbon dynamics of pelagic environments. Overall, the experimental works presented in Chapters I and II support a scenario where MP pollution affects HGT dynamics among aquatic bacteria. Among the consequences of this alteration is an increase in the mobilization and transfer efficiency of ARGs. Moreover, it supposes that changes in HGT can affect the evolution of bacteria and the processing of organic matter, leading to different catabolic profiles such as demonstrated in Chapter III. The results are discussed in the context of the fate and magnitude of plastic pollution and the importance of HGT for bacterial evolution and the microbial loop, i.e., at the base of aquatic food webs. The thesis supports a relevant role of MP biofilm communities for the changes observed in the aquatic microbiome as a product of intense human intervention.…
• Die Plastikverschmutzung ist auf dem Planeten allgegenwärtig, da jährlich mehrere Millionen Tonnen Plastikabfall in die aquatische Ökosystemen gelangen. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Menge an produziertem Plastik in naher Zukunft exponentiell ansteigen wird. Die Heterogenität der Kunststoffmaterialien, ihrer Additive und physikalischen Eigenschaften ist typisch für diese neu auftretenden Schadstoffe und beeinflusst deren Umweltverhalten in Meeres- und Süßwasser. Als Folge kann Plastik in der Wassersäule, den Sedimenten oder Küstenlebensräumen aller aquatischen Ökosysteme gefunden werden. Die meisten dieser Plastikabfälle fragmentieren durch das Zusammenspiel physikalischer, chemischer und biologischer Kräfte, wodurch kleine Partikel erzeugt werden. Diese Partikel (<5mm) sind auch bekannt als "Mikroplastik" (MP). Aufgrund ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses stimuliert MP das Biofouling und somit die Bildung von Biofilmen in aquatischen Systemen. Aufgrund ihrer einzigartigen Struktur und Zusammensetzung werden dieDie Plastikverschmutzung ist auf dem Planeten allgegenwärtig, da jährlich mehrere Millionen Tonnen Plastikabfall in die aquatische Ökosystemen gelangen. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Menge an produziertem Plastik in naher Zukunft exponentiell ansteigen wird. Die Heterogenität der Kunststoffmaterialien, ihrer Additive und physikalischen Eigenschaften ist typisch für diese neu auftretenden Schadstoffe und beeinflusst deren Umweltverhalten in Meeres- und Süßwasser. Als Folge kann Plastik in der Wassersäule, den Sedimenten oder Küstenlebensräumen aller aquatischen Ökosysteme gefunden werden. Die meisten dieser Plastikabfälle fragmentieren durch das Zusammenspiel physikalischer, chemischer und biologischer Kräfte, wodurch kleine Partikel erzeugt werden. Diese Partikel (<5mm) sind auch bekannt als "Mikroplastik" (MP). Aufgrund ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses stimuliert MP das Biofouling und somit die Bildung von Biofilmen in aquatischen Systemen. Aufgrund ihrer einzigartigen Struktur und Zusammensetzung werden die mikrobiellen Gemeinschaften in MP-Biofilmen als "Plastisphäre" bezeichnet. Während es immer mehr Daten über die spezifische Zusammensetzung und Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften – die Teil dieser Plastisphäre sind – gibt, existieren hingegen nur wenige Informationen über die Aktivität von Mikroorganismen in MP-Biofilmen. Dieser Lebensstil des Anheftens und Besiedelns von Oberflächen ist oft mit der Zunahme von horizontalem Gentransfer (HGT) unter Bakterien verknüpft. Diese Art der mikrobiellen Aktivität stellt eine besonders relevante Funktion dar und sollte daher in MP-Biofilmen analysiert werden. Der horizontale Austausch von mobilen genetischen Elementen (MGEs) ist ein wesentliches Merkmal von Bakterien. Er ist verantwortlich für die schnelle Evolution dieser Prokaryoten und ihre Anpassungsfähigkeit an verschiedenste Umweltbedingungen. Der Prozess des HGT ist zudem entscheidend für die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen sowie für die Entwicklung von Pathogenen, da viele MGEs bekanntermaßen Antibiotikaresistenzgene (ARGs) und genetische Determinanten für Pathogenität enthalten. Im Allgemeinen konzentriert sich die Forschung in der vorliegenden Dissertation auf die Analyse des HGT und der heterotrophen Aktivität in MP-Biofilmen in aquatischen Ökosystemen. Das Hauptziel besteht darin, das Potenzial des Genaustausches zwischen MP-Bakteriengemeinschaften und dem des umgebenden Wassers, einschließlich der Bakterien in natürlichen Aggregaten, zu analysieren. Darüber hinaus befasst sich diese Doktorarbeit mit dem Potenzial von MP-Biofilmen zur Ausbreitung biologisch gefährlicher Bakterien und MGEs, die aus Kläranlagen stammen und mit Antibiotikaresistenzen assoziiert sind. Schließlich soll bei verschiedenen limnologischen Bedingungen überprüft werden, ob das jeweilige physiologische Profil von MP-Biofilmen von dem der Wassergemeinschaften abweicht. Dementsprechend besteht die Arbeit aus drei unabhängigen Studien, die in Fachzeitschriften veröffentlicht wurden. In den beiden Laborstudien wurden sowohl mikrobielle Modell- als auch Umwelt-Gemeinschaften betrachtet. Im Freilandexperiment wurden schließlich die natürlichen Gemeinschaften aus Süßwasserökosystemen untersucht. In Kapitel I wurde der Zufluss von geklärtem Abwasser mit einem Konzentrationsgradienten von MP-Partikeln in einen See der gemäßigten Klimazone simuliert. Dabei wurden die Effekte von MP auf die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur und das Auftreten von Integrase 1 (int 1) verfolgt. Int 1 ist ein Marker, der mit mobilen genetischen Elementen assoziiert ist und zur Abschätzung anthropogener Einflüsse auf die Ausbreitung antimikrobieller Resistenzgene verwendet ist. Während des Experiments erhöhte sich das Vorkommen von Int1 in der Plastisphäre mit zunehmender MP-Partikelkonzentration, jedoch nicht im umgebenden Wasser. Darüber hinaus ähnelte die mikrobielle Gemeinschaft auf MP zunehmend der ursprünglichen Abwassergemeinschaft mit steigender Mikroplastikkonzentration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Mikroplastikpartikel tatsächlich die Persistenz von Standardindikatoren mikrobieller anthropogener Verschmutzung in natürlichen Gewässern fördern. In Kapitel II wurde die Permissivität von aquatischen Bakterien gegen das Modell-Plasmid für Antibiotikaresistenz pKJK5 zwischen Gemeinschaften, die Biofilme auf MP bilden, gegenüber denen, die frei leben, verglichen. Die Häufigkeit des Plasmidtransfers unter den MP-assoziierten Bakterien war höher als unter Bakterien, die frei oder in natürlichen Aggregaten leben. Der verstärkte Genaustausch trat darüber hinaus bei einem breiten Spektrum phylogenetisch diverser Bakterien auf. Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Aktivität von HGT in MP-Biofilmen hin, welche die Ökologie aquatischer mikrobieller Gemeinschaften auf globaler Ebene sowie die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beeinflussen könnten. Schließlich wurden in Kapitel III physiologische Messungen durchgeführt, um festzustellen, ob Mikroorganismen auf MP eine andere funktionelle Diversität aufwiesen als jene im Wasser. Die generelle heterotrophe Aktivität, wie der Sauerstoffverbrauch, wurde in Mikrokosmentests mit und ohne MP verglichen, während die Diversität und Vielfalt heterotropher Aktivitäten mit Hilfe von Biolog® EcoPlates berechnet wurden. Drei Seen mit unterschiedlichen Nährstoffbedingungen wiesen Unterschiede in der Ausprägung der MP-assoziierten Biomasse auf. In allen Seen unterschieden sich die funktionellen Diversitätsprofile der MP-Biofilme von denen der Gemeinschaften im umgebenden Wasser, aber nur die MP-Biofilme des oligo-mesotrophen Sees hatten eine höhere funktionelle Vielfalt im Verglichen zum Umgebungswasser. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass MP-Oberflächen als neue Nischen für aquatische Mikroorganismen fungieren und die globale Kohlenstoffdynamik im Pelagial beeinflussen können. Insgesamt unterstützen die in den Kapiteln I und II vorgestellten experimentellen Studien ein Szenario, in dem die Umweltverschmutzung durch MP die HGT-Dynamik zwischen aquatischen Bakterien beeinflusst. Zu den Folgen dieser Veränderung gehört eine Erhöhung der Mobilisierungs- und Übertragungseffizienz von ARGs. Darüber hinaus wird vermutet, dass eine Beeinflussung des HGT die Evolution von Bakterien und die Umsetzung von organischem Material verändern könnte, was zu verschiedenen katabolischen Profilen führt, wie in Kapitel III gezeigt. Die Ergebnisse werden in Zusammenhang mit dem Ausmaß der Plastikverschmutzung sowie der Bedeutung von HGT für die bakterielle Entwicklung und „mikrobielle Schleife“, d. h. an der Basis der aquatischen Nahrungsnetze, diskutiert. Diese Doktorarbeit veranschaulicht die Bedeutung von MP-Biofilmgemeinschaften für die beobachteten Veränderungen des aquatischen Mikrobioms als eine Folge der intensiven anthropogenen Eingriffe.…