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Entwicklung eines Schnelldetektionssystems zum Nachweis von Orthopockenviren
Stern, Daniel
Die Famile der Orthopockenviren umschließt neben den zwar ausgerotteten, im Falle
einer nicht auszuschließenden bioterroristischen Ausbringung aber hochgefährlichen
Variolaviren weitere humanpathogene Viren wie das Affenpocken-, das Kuhpockensowie
das Vacciniavirus. Als zoonotische Erreger endemisch in Zentral- und Westafrika,
Europa sowie Südamerika, verursachen Sie lokal begrenzt bis systemisch verlaufende
pustuläre Erkrankungen, welche in Einzelfällen bis zum Tod führen können.
Aufgrund des seltenen Auftretens sind deutschlandweit nur wenige Speziallabore wie
das Robert Koch-Institut in der Lage, den Nachweis einer Orthopockenvirusinfektion
anhand serologischer, Nukleinsäure- oder Partikel-basierter Nachweisverfahren zu
erbringen. Ein im Falle einer bioterroristischen Freisetzung von Variolaviren notwendiges
schnelles, sensitives und einfach durchzuführendes Detektionssystem existiert
bis heute jedoch nicht.
Um diese Lücke zu schließen, war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines
Antikörper-basierten Schnelldetektionssystems zum Nachweis von Orthopockenviren.
Durch Testung Oberflächenprotein-spezifischer polyklonaler Antikörper konnte
gezeigt werden, dass das Attachment-Protein A27 am geeignetsten zur Induktion Detektions-
optimierter Antikörper ist. In einem mehrstufigen Screeningverfahren wurden
daher monoklonale Antikörper gegen A27 generiert, deren Bindungsepitope und
Bindungskinetik mittels Peptid-Epitopmapping und Oberflächenplasmonresonanz-
Messung bestimmt wurden. Hierbei zeigte sich, dass gute Zugänglichkeit der Bindungsepitope
sowie schnelle und multivalente Bindung entscheidend für Detektionsoptimierte
Antikörper waren. Die beiden besten Antikörper wurden schließlich auf
der Abicap Vor-Ort-Detektionsplattform implementiert und bezüglich Sensitivität
und Spezifität beim Orthopockenvirusnachweis charakterisiert. Als Ansatzpunkt für
potenzielle Weiterentwicklungen wurden diese zusätzlich in Form rekombinanter single
chain fragment variable Antikörper exprimiert und getestet.
Das etablierte Detektionssystem war in der Lage, alle getesteten humanpathogenen
Orthopockenviren mit hoher Sensitivität von bis zu 1,75×10^2 PFU/ml in 45 Minuten
zu detektieren, wobei der Nachweis aus klinischem Material sowie einem verblindetem
Probenpanel ohne Kreuzreaktivitäten möglich war. Durch die schnelle und einfache
Durchführbarkeit bei gleichzeitig hoher Sensitivität eignet sich das Abicap-System
sehr gut für die Vor-Ort-Testung sowohl bioterroristischer als auch klinischer Proben.
Darüber hinaus können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Generierung
Detektions-optimierter Antikörper auf anderer Erreger übertragen werden.
Besides the eradicated Variola virus, which in the case of an unlikely but non excludable
bioterrorist attack nevertheless remains highly dangerous, the Orthopoxvirus
family contains further viruses pathogenic for humans like Monkeypox, Cowpox,
and Vaccinia virus. As zoonotic agents, they are endemic in Central and Western
Africa, Europe, and South America, causing mainly local to systemic pustular
diseases which, in rare cases, can lead to death. Due to their rare incidence, only
a few specialized laboratories like the Robert Koch-Institute are able to diagnose
orthopoxvirus infections via serological, nucleic acid, or virus-particle based detection
methods. However, to date there is no fast, sensitive and simple rapid on-site
detection system, which in the case of bioterrorist release of Variola virus would be
needed.
To fill this gap, the aim of this work was to develop an antibody-based rapid detection
system for Orthopoxviruses. By testing surface protein-specific polyclonal antibodies,
we could show that the attachment protein A27 is most suited for induction
of detection-optimized antibodies. Hence, a multi-level screening was used to generate
A27-specific monoclonal antibodies whose binding epitopes and kinetics were
determined by peptide epitope mapping and surface plason resonance measurement.
Hereby, high accessibility of binding epitopes as well as rapid and multivalent binding
were hallmarks for detection-optimized antibodies. Finally, two outperforming antibodies
were implemented on the Abicap onsite detection platform and characterized
regarding their sensitivity and specificity in Orthopoxvirus detection. Additionally,
as a starting point for further optimization, both antibodies were expressed as recombinant
single-chain variable fragments.
The established rapid detection system was able to detect all tested Orthopoxviruses
pathogenic to humans with high sensitivity down to 1.75×10^2 PFU/ml within 45
minutes. Detection was possible from clinical samples and a blinded sample panel
without cross-reactivity. Due to rapid and simple handling at sustained high sensitivity,
the Abicap-platform is highly suited for onsite testing in a bioterrorist as well
as a clinical context. Furthermore, findings regarding the generation of detectionoptimized
antibodies gained during this work could be transferred to other agents.
